UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Química de Minas Gerais Dilaine Suellen Caires Neves DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS BASEADAS EM SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS PARA DETERMINAÇÃO DE METAIS EM AMOSTRAS DE ALIMENTOS Diamantina – MG 2022 DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS BASEADAS EM SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS PARA DETERMINAÇÃO DE METAIS EM AMOSTRAS DE ALIMENTOS Tese de doutorado apresentada ao programa de Pós- Graduação Multicêntrico em Química de Minas Gerais da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como requisito para obtenção do título de Doutora em Química. Orientador: Prof. Dr. Leandro Rodrigues de Lemos Coorientador: Prof. Dr. Anderson Santos Souza Diamantina 2022 Catalogação na fonte - Sisbi/UFVJM C136 2022 Caires Neves, Dilaine Suellen Desenvolvimento de metodologias analíticas baseadas em sistemas aquosos bifásicos para determinação de metais em amostras de alimentos [manuscrito] / Dilaine Suellen Caires Neves. -- Diamantina, 2022. 136 p. : il. Orientador: Prof. Leandro Rodrigues de Lemos. Coorientador: Prof. Anderson Santos Souza. Tese (Doutorado Multicêntrico em Química) -- Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Programa de Pós- Graduação em Multicêntrico em Química de Minas Gerais, Diamantina, 2022. 1. Pré-concentração. 2. Determinação de metais em alimentos. 3. Desenvolvimento de metodologias analiticas. 4. Sisitema aquoso bifásico. I. Rodrigues de Lemos, Leandro. II. Santos Souza, Anderson. III. Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri. IV. Título. Elaborada pelo Sistema de Geração Automática de Ficha Catalográfica da UFVJM com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Este produto é resultado do trabalho conjunto entre o bibliotecário Rodrigo Martins Cruz/CRB6- 2886 e a equipe do setor Portal/Diretoria de Comunicação Social da UFVJM MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI DILAINE SUELLEN CAIRES NEVES DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS BASEADAS EM SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS PARA DETERMINAÇÃO DE METAIS EM AMOSTRAS DE ALIMENTOS Tese de doutorado apresentada ao programa de Pós- Graduação Mulcêntrico em Química de Minas Gerais da Universidade Federal dos Vales do Jequinhonha e Mucuri, como requisito parcial para obtenção do tulo de Doutora em Química Orientador: Prof. Dr. Leandro Rodrigues de Lemos Data da aprovação: _24_/__08__/__2022__ ____________________________________________________ Prof. Dr. Lucas Franco Ferreira Universidade Federal dos Vales do Jequinhonha e Mucuri- UFVJM _________________________________________________ Prof. Dr. Valfredo Azevedo Lemos Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – UESB ___________________________________________________ Prof. Dr. Marcos de Almeida Bezerra Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – UESB _____________________________________________________ Prof. Dr. Flaviano Oliveira Silvério Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG _____________________________________________________ Prof. Dr. Leandro Rodrigues de Lemos Universidade Federal doa Vales do Jequinhonha e Mucuri - UFVJM Documento assinado eletronicamente por Leandro Rodrigues de Lemos, Docente, em 24/08/2022, às 18:13, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015. Documento assinado eletronicamente por Lucas Franco Ferreira, Docente, em 24/08/2022, às 18:17, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015. Documento assinado eletronicamente por Marcos de Almeida Bezerra, Usuário Externo, em 24/08/2022, às 19:53, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015. Documento assinado eletronicamente por Flaviano Oliveira Silvério, Usuário Externo, em 25/08/2022, às 07:18, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015. Documento assinado eletronicamente por Valfredo Azevedo Lemos, Usuário Externo, em 25/08/2022, às 10:38, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015. A autencidade deste documento pode ser conferida no site hps://sei.ufvjm.edu.br/sei/controlador_externo.php?acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0, informando o código verificador 0821634 e o código CRC EB99E5AE. Referência: Processo nº 23086.011212/2022-39 SEI nº 0821634 AGRADECIMENTOS A Deus, por me guiar, amparar e sempre me fortalecer para que este momento tão importante e sonhado se concretizasse. Aos meus pais, Lucidalva e Messias, pelo amor e dedicação e por sempre me apoiarem nos meus sonhos, não medindo esforços para que se realizassem. A minha mãe, que foi uma das minhas primeiras professoras e uma das responsáveis pela minha formação acadêmica. Ao meu marido, Alan, pelo amor, carinho e por sempre me apoiar e incentivar para que fosse possível realizar mais um sonho. Ele que tem me ensinado a ser sempre grata com a vida e valorizar cada conquista. Aos meus irmãos, Orlando Deise e Cláudio, por sempre estrarem presente na minha jornada com tanta cumplicidade e amor. A Orlando, Vanêssa, Mariana e Maurício, pessoas especiais que tanto me ajudaram e estiveram presente durante a minha formação, contribuindo diretamente para que fosse possível chegar até aqui. Ao meu Orientador, Leandro, e coorientador, Anderson, por acreditarem na parceria que firmamos e por sempre estarem disponíveis a qualquer momento para que fosse possível a realização deste trabalho. Obrigada a vocês por cada ensinamento e por compartilharem o amor pela docência e pesquisa com tanta leveza e dedicação. A meu amigo e irmão de alma, Klebson, por sempre me apoiar e me mostrar que podemos conquistar o mundo e ter muita leveza na condução da nossa vida. Aos meus colegas do NUAL (Núcleo de apoio ao laboratório – UFBA), que não mediram esforços para que eu pudesse me ausentar para a pesquisa e pelo incentivo diário. Aos meus queridos companheiros de laboratório da UFVJM, Laryssa, Keyciane e Alício que me acolheram em Diamantina e que tanto me ajudaram colaborando para meu trabalho. Ao amigo da UFBA, Robson, e Prof. Douglas da UESB pela disponibilidade e colaboração com minha pesquisa. A toda minha família, que sempre esteve comigo nas minhas conquistas e que com amor sempre mostrou que podemos chegar mais longe e realizar nossos sonhos. Agradeço a UFVJM e UFBA e as agências de fomento (CAPES, CNPQ e FAPEMIG) pelo apoio financeiro e estrutura, tornando possível a realização deste trabalho. RESUMO A extração de metais utilizando sistemas aquosos bifásicos (SAB) está bem estabelecida na literatura, porém a aplicação desta técnica no desenvolvimento de metodologias analíticas ainda é incipiente. Este trabalho objetivou o desenvolvimento de três métodos simples, de baixo custo e livres de solventes orgânicos para pré-concentração e determinação de íons metálicos em amostras de alimentos, explorando a versatilidade dos SAB´s, com detecção via FAAS (espectrometria de absorção atômica com chama). No primeiro método, foi desenvolvida uma metodologia para pré-concentração de íons Cd(II) e Mn(II) na fase inferior do sistema formado por K2HPO4 + PEG4000 + H2O sem uso de qualquer agente complexante, o qual foi otimizado empregando um planejamento de Doehlert. O método alcançou valores de LD (0,450 µg kg-1 para Cd(II) e 6,40 µg kg-1 para Mn(II)) e fator de enriquecimento (16,0 para Cd(II) e 45,0 para Mn(II)) adequados para determinar os dois analitos em amostras de alimentos. As análises das amostras certificadas de folhas de pinheiro, NIST1575a, e de folhas de maçã, NIST1515, mostraram a exatidão da metodologia desenvolvida, a qual foi aplicada a diversas amostra de alimentos apresentando recuperações entre 94,0 e 110% para ambos analitos. No segundo método, foi realizada a extração e pré-concentração de vanádio na fase superior do SAB formado por PEG400 + (NH4)2SO4 + H2O, com uso do complexante Br-PADAP. A otimização da metodologia foi realizada empregando um planejamento multivariado Box-Behnken, sendo que nas condições otimizadas o método apresentou LD de 0,0220 μg kg-1 e fator de enriquecimento de 19,1. A metodologia foi aplicada em amostras de referência certificada de folhas de maçã, NIST1515, e em amostras de alimentos com valores de porcentagem de recuperação de 94,1% e 93,8-108%, respectivamente. No terceiro método, foi realizada de forma simultânea a determinação de íons cobalto e níquel em um SAB formado por Triton X- 100 + Na2SO4 + H2O na presença do complexante PAR. Nas condições otimizadas através de planejamento Box-Behnken, a metodologia apresentou valores de LD de 0,330 e 0,0370 µg kg- 1; fator de enriquecimento de 20,3 e 16,7 para Co e Ni, respectivamente. Recuperações entre 97,4-97,9% e 96,6-106% foram obtidas para a amostra certificada NIST1515 e amostras de alimentos para Co e Ni, respectivamente. Os métodos desenvolvidos mostraram a versatilidade dos SAB para aplicações analíticas, apresentando figuras de mérito adequadas para determinação de metais em amostras de alimentos, além de serem livres de solventes orgânicos, contemplando alguns dos princípios da Química Analítica Verde. Palavras-Chave: pré-concentração; metodologias analíticas; sistemas aquosos bifásicos; amostras de alimentos; metais; pré-concentração. ABSTRACT The extraction of metals using aqueous two-phase systems (ATPS) is already well established in the literature, but the application of this technique in the development of analytical methodologies is still incipient. This work aimed to develop simple, low cost and organic solvent-free methods for preconcentration and determination of metals in food samples exploring the versatility of ATPS, with detection by FAAS. In Chapter I, the metallic ions Cd(II) and Mn(II) were preconcentrated in the bottom-phase of the system formed by K2HPO4 + PEG4000 + H2O without the use of any complexing agent. The method was optimized employing a Doehlert matrix reaching values of LOD (0.450 µg kg-1 for Cd(II) and 6.40 µg kg- 1 for Mn(II)) and enrichment factor (16.0 for Cd(II) and 45.0 for Mn(II)) suitable for determining the two analytes in food samples. The analyses of NIST1575a (recovery of Cd = 98.2%) and NIST1515 (recovery of Mn = 99.2%) certified samples showed the accuracy of the developed methodology, which was applied to several food samples obtaining recoveries between 94.0 and 110% for both analytes. In Chapter II, the extraction and preconcentration of vanadium occurred in the top-phase of the ATPS formed by PEG400 + (NH4)2SO4 + H2O, using the complexant Br-PADAP. The methodology was optimized using Box-Behnken multivariate design, and under the optimized conditions the method showed LOD of 0.0220 μg.kg-1 and enrichment factor of 19.1. The methodology was applied to certified apple leaf reference samples (NIST1515) and food samples with percent recovery values of 94.1% and 93.8-108%, respectively. In Chapter III, the determination of cobalt and nickel was performed simultaneously in ATPS formed by Triton X-100 + Na2SO4 + H2O using the complexant PAR. Under optimized conditions through Box-Behnken multivariate, the methodology presented LOD values of 0.330 and 0.0370 µg kg-1, enrichment factor of 20.3 and 16.7, and precision of 6.32% and 7.37% for Co and Ni, respectively. Recoveries between 97.6-97.9% and 96.6-106% were obtained for the NIST1515 certified sample and food samples. The developed methods showed the versatility of the ATPS technique for analytical applications, the figures of merit are suitable for determination of metals in food samples and, in addition, are organic solvents- free being in accordance with the principles of Green Analytical Chemistry. Keywords: preconcentration; analytical method; aqueous two-phase systems; food samples; metals Lista de Figuras Figura 1 – Esquema de um sistema de microextração em fase líquida: (A) sistema contendo a amostra, sendo adicionado complexante, agente extrator e dispersor (B) extração e pré- concentração do analito na gota formada na fase inferior do tubo---------------------------------32 Figura 2 – Esquema geral de sistema de extração no ponto nuvem: (A) formação das micelas do analito e surfactante (B) as micelas se depositam no fundo do tubo, ocorrendo a pré- concentração ----------------------------------------------------------------------------------------------33 Figura 3 – Parâmetros termodinâmicos de um SAB formado por PEG4000; sulfato de sódio e água a 25ºC -----------------------------------------------------------------------------------------------35 Figura 4 – Diagrama de fases de um SAB formado por polímero + eletrólito + água expresso em coordenadas retangulares ---------------------------------------------------------------------------36 Figura 5 – Diagrama de um espectrômetro de absorção atômica com chama -------------------40 Figura 6 – Superfícies de resposta e curvas de nível (a) com ponto máximo, (B) com ponto mínimo e (c) com ponto de sela ------------------------------------------------------------------------44 Figura 7 – Desenho de planejamento Doehlert para duas variáveis (I) e para três variáveis (II) - --------------------------------------------------------------------------------------------------------------46 Figura 8 – Projeto Box-Behnken: a) o cubo para BBD b) planejamento fatorial 22 interligados --------------------------------------------------------------------------------------------------------------48 Capítulo I – Desenvolvimento de metodologia usando sistema aquoso bifásico para extração e pré-concentração de cádmio e manganês em amostras de alimentos sem agente extrator -----56 Figura 1.1 – Fotografia do SAB preparado em diferentes proporções de razão mássica -------64 Figura 1.2 – Esquema do procedimento de extração e pré-concentração na fase inferior usando SAB ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65 Figura 1.3 – Superfícies de resposta para o planejamento Doehleth: análise de pH e ânion do sal (I), pH e massa molar do polímero (II) e ânion do sal e massa molar do polímero (III)----71 Figura 1.4 – Gráfico de paridade do modelo de eficiência observado ----------------------------73 Figura 1.5 – Comportamento de extração de Cd (II) em função da razão de massa entre as fases em vários valores de CLA. CLA=32,63 (■), CLA = 44,61 (●) e CLA = 53,31 (▲). SAB: PEG 4000 + K2HPO4 + H2O a 298,15K --------------------------------------------------------------------- 74 Figura 1.6 – Sistema aquoso formado por PEG 4000 + K2HPO4 + H2O para pré-concentração de Cd (II) e Mn (II) ---------------------------------------------------------------------------------------76 Figura 1.7 – Efeito do tempo de extração no comportamento de extração de Cd(II). SAB: PEG 4000 + K2HPO4 + H2O a 298,15K ---------------------------------------------------------------------77 Figura 1.8 – Curva de calibração com (●) e sem pré-concentração (■) para cádmio -----------80 Figura 1.9 – Curva de calibração com (●) e sem pré-concentração (■) para manganês --------80 Capitulo II – Nova metodologia de extração e pré-concentração de vanádio em amostras de alimentos usando sistema aquoso bifásico ------------------------------------------------------------87 Figura 2.1 – Esquema do procedimento de extração e pré-concentração na fase superior usando SAB (I) e separação de fases com formação do complexo na fase superior (II) -----------------93 Figura 2.2 – Gráfico de Pareto para planejamento fatorial de dois níveis ------------------------99 Figura 2.3 – Estrutura química do complexante Br-PADAP --------------------------------------100 Figura 2.4 – Superfícies de resposta para o planejamento Box-Behnken: análise de concentração de Br-PADAP e tempo de banho ultra-termostatizado (I), pH e tempo de banho ultra- termostatizado (II) e pH e concentração de Br-PADAP (III) --------------------------------------101 Figura 2.5 – Porcentagem de extração de V(V) em função da razão mássica entre as fases na CLA = 43,46 m/m (■) e CLA = 52,22 m/m (●) -----------------------------------------------------103 Figura 2.6 – Curva de calibração direta (■) e pré-concentrada (●) para vanádio ---------------105 Capitulo III – Determinação de cobalto e níquel em amostras de alimentos após pré- concentração simultânea usando sistema aquoso bifásico formado por surfactante ------------111 Figura 3.1 – Esquema com etapas da metodologia de extração e pré-concentração de cobalto e níquel em um SAB (I) usando PAR como complexante (II) --------------------------------------116 Figura 3.2 Equação química de formação do complexo entre o complexante PAR e o íon metálico ------------------------------------------------------------------------------------------------- 119 Figura 3.3 – Gráfico de pareto para planejamento fatorial de dois níveis -----------------------122 Figura 3.4 – Superfícies de resposta para o desenho Box-Behnken: análise de tempo de banho ultra-termostatizado e concentração de complexante (I), tempo de banho ultra-termostatizado e pH (II) e concentração de complexante e pH (III) -------------------------------------------------125 Figura 3.5 – Comportamento de extração de Níquel (I) e Cobalto (II) em função da razão de massa entre as fases em CLA = 14,49 (■), CLA = 18,90 (●), CLA = 23,38 (▲) e CLA = 27,69 (▼). SAB: triton X-100 + Na2SO4 + H2O à 293,15K ----------------------------------------------126 Figura 3.6 – Curva de calibração com (●) e sem pré-concentração (■) para níquel ------------128 Figura 3.7 – Curva de calibração com (●) e sem pré-concentração (■) para cobalto ----------128 Lista de tabelas Tabela 1- Publicações cientificas para determinação de metais usando sistema aquoso bifásico (SAB) ------------------------------------------------------------------------------------------------------39 Capítulo I – Desenvolvimento de metodologia usando sistema aquoso bifásico para extração e pré-concentração de cádmio e manganês em amostras de alimentos sem agente extrator -----56 Tabela 1.1 – Composição do SAB estudada com concentração expressa em porcentagem (m/m) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------63 Tabela 1.2 – Matriz Doehlert para três variáveis independentes com valores e resposta codificados e não codificados --------------------------------------------------------------------------69 Tabela 1.3 – Análise de variância (ANOVA) para o modelo quadrático ajustado -------------- 72 Tabela 1.4 – Efeito de íons interferentes na extração de cádmio e manganês --------------------78 Tabela 1.5 – Características analíticas do sistema PEG 4000 + K2HPO4 + H2O na pré- concentração de cádmio e manganês ------------------------------------------------------------------79 Tabela 1.6 – Determinação de cádmio no material de referência certificado no NIST 1575a e manganês no NIST 1515 --------------------------------------------------------------------------------81 Tabela 1.7 – Determinação de cádmio e manganês em amostras de café solúvel e chá verde -82 Capitulo II – Nova metodologia de extração e pré-concentração de vanádio em amostras de alimentos usando sistema aquoso bifásico ------------------------------------------------------------87 Tabela 2.1 – Matriz de planejamento fatorial 24 com resultados -----------------------------------94 Tabela 2.2 – Tabela de matriz Box-Behnken para três variáveis com resultados ----------------95 Tabela 2.3 – Limite máximo de íons interferentes tolerados no sistema aquoso bifásico para determinação de vanádio ------------------------------------------------------------------------------104 Tabela 2.4 – Determinação de V(V) em amostras de alimentos após pré-concentração usando sistema aquoso bifásico --------------------------------------------------------------------------------106 Capitulo III – Determinação de cobalto e níquel em amostras de alimentos após pré- concentração simultânea usando sistema aquoso bifásico formado por surfactante ------------111 Tabela 3.1 – Matriz do planejamento fatorial 24 desejabilidade individuais e global ----------121 Tabela 3.2 – Matriz Box-Behnken para três variáveis para Cobalto e Níquel e desejabilidade individuais e global -------------------------------------------------------------------------------------123 Tabela 3.3 – Análise de variância (ANOVA) para o modelo quadrático ajustado a desejabilidade global ao nível de 95% de confiança -----------------------------------------------------------------124 Tabela 3.4 – Limite máximo de íons interferentes tolerados no sistema aquoso bifásico para determinação de cobalto e níquel ---------------------------------------------------------------------127 Tabela 3.5 - Determinação de Co (II) e Ni (II) pelo método proposto em material de referência certificado NIST 1515----------------------------------------------------------------------------------129 Tabela 3.6 - Determinação de Co (II) e Ni (II) em amostras de alimentos após pré-concentração usando sistema aquoso bifásico -----------------------------------------------------------------------130 LISTA DE ABREVIATURAS SAB – Sistema aquoso bifásico CLA – Comprimento da linha de amarração FS – Fase superior FI – Fase inferior PEG – Poli (etileno glicol) CFS – Composição da fase superior CFI – Composição da fase inferior MM – Massa molar Br-PADAP – 2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-(diethylamino)phenol IARC – International Agency for Research on Cancer PAR - (4-(2-Pyridylazo) resorcinol FAAS – Flame atomic absorption spectrometry LD – Limite de detecção LQ – Limite de quantificação DPR – Desvio padrão relativo NIST - Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia FE – Fator de enriquecimento LPME - Liquid-phase microextraction SPME - Solid phase micro extraction EPN - Extração no ponto nuvem SPDE – Solid phase dinamic extraction DLLME – Dispersive liquid-liquid microextration ICP-MS - Inductively coupled plasma mass spectrometry GFAAS – Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry UV-Vis - Espectroscopia no ultravioleta visível HF-LPME - Hollow fiber liquid-phase microextraction SDME - Single drop microextraction SFODME - Solidified. floating oganic drop microextraction SUMÁRIO 1. Introdução _____________________________________________________ 20 2. Objetivos ______________________________________________________ 24 2.1. Objetivo Geral ______________________________________________ 24 2.2. Objetivos Específicos _________________________________________ 24 3. Referencial Teórico______________________________________________ 25 3.1. Metais em amostras de alimentos ________________________________ 25 3.1.1. Cádmio __________________________________________________ 25 3.1.2. Manganês ________________________________________________ 27 3.1.3. Vanádio __________________________________________________ 27 3.1.4. Cobalto __________________________________________________ 28 3.1.5. Níquel ___________________________________________________ 29 3.2. Técnicas de pré-concetração __________________________________ 30 3.3. Sistema Aquoso Bifásico (SAB) ________________________________ 33 3.3.1. Conceitos e propriedades ____________________________________ 33 3.4. Extração e pré-concentração de íons metálicos em SAB ___________ 37 3.5. Espectrometria de Absorção Atômica com chama ________________ 40 3.6. Otimização multivariada _____________________________________ 41 2.6.1 Metodologia de superfície de resposta____________________________ 42 3.6.1. Matriz Doehlert____________________________________________ 45 3.6.2. Matriz Box-Behnken _______________________________________ 47 4. Referências Bibiligráficas ________________________________________ 49 Capítulo I – Desenvolvimento de uma metodologia analítica baseada em sistema aquoso bifásico para determinação de cadmio e manganês em amostras de alimentos _______ 56 Resumo ____________________________________________________________ 57 1. Introdução _____________________________________________________ 58 2. Procedimento Experimental ______________________________________ 61 2.1. Reagentes __________________________________________________ 61 2.2. Instrumentação _____________________________________________ 61 2.3. Preparo de soluções estoque __________________________________ 61 2.4. Otimização Multivariada _____________________________________ 62 2.4.1. Planejamento Doehlert ______________________________________ 62 2.5. Otimização Univariada ______________________________________ 63 2.5.1. Escolha do melhor CLA _____________________________________ 63 2.5.2. Melhor tempo de extração ___________________________________ 65 2.5.3. Extração de íons metálicos em ensaios com SAB _________________ 65 2.5.4. Interferentes ______________________________________________ 66 2.6. Preparo de amostras reais e material certificado _________________ 66 2.7. Características Analíticas ____________________________________ 67 3. Resultados e Discussão ___________________________________________ 68 3.1. Design Experimental ________________________________________ 68 3.2. Estudo da razão mássica e melhor CLA _________________________ 73 3.3. Tempo de Extração __________________________________________ 76 3.4. Estudo de Interferentes ______________________________________ 77 3.5. Características Analíticas ____________________________________ 79 3.6. Aplicação em amostras Reais _________________________________ 81 4. Conclusão _____________________________________________________ 83 5. Referências Bibliográficas ________________________________________ 84 Capítulo II - Nova metodologia de extração e pré-concentração de vanádio em amostras de alimentos usando sistema aquoso bifásico ___________________________________ 87 Resumo ____________________________________________________________ 88 1. Introdução _____________________________________________________ 89 2. Parte Experimental______________________________________________ 92 2.1. Reagentes __________________________________________________ 92 2.2. Instrumentação _____________________________________________ 92 2.3. Metodologia ________________________________________________ 92 2.3.1. Preparação do Sistema Aquoso Bifásico ________________________ 92 2.3.2. Otimização multivariada_____________________________________ 93 2.3.3. Estudo do efeito da razão mássica e da concentração dos componentes formadores do SAB ______________________________________________ 95 2.3.4. Características analíticas __________________________________ 96 2.3.5. Íons Interferentes __________________________________________ 96 2.3.6. Aplicação em amostras reais _________________________________ 96 3. Resultados e Discussão ___________________________________________ 98 3.1. Otimização multivariada _____________________________________ 98 3.2. Razão mássica e melhor CLA ________________________________ 102 3.2.1. Íons Interferentes _______________________________________ 103 3.3. Características analíticas ____________________________________ 105 3.4. Aplicação em amostras Reais ________________________________ 106 4. Conclusão __________________________________________________ 108 5. Referências Bibliográficas _______________________________________ 109 Capitulo III - Determinação de Cobalto e Níquel em amostras de alimentos após preconcentração simultânea utilizando sistema aquoso bifásico formado por surfactante _______________________________________________________________________ 111 Resumo ___________________________________________________________ 112 1. Introdução ____________________________________________________ 113 2. Procedimento Experimental _____________________________________ 115 2.1. Reagentes _________________________________________________ 115 2.2. Instrumentação ____________________________________________ 115 2.3. Metodologia _______________________________________________ 115 2.3.1. Otimização multivariada____________________________________ 116 2.3.2. Características analíticas____________________________________ 117 2.3.3. Razão mássica e melhor CLA _______________________________ 118 2.3.4. Estudo de íons interferentes _________________________________ 118 2.3.5. Aplicação em amostras reais ________________________________ 118 3. Resultados e Discussão __________________________________________ 119 3.1. Análise Multivariada ________________________________________ 120 3.2. Razão mássica e CLA ________________________________________ 126 3.3. Estudo de íons interferentes ___________________________________ 127 3.4. Características Analíticas _____________________________________ 128 3.5. Aplicação em amostra real ____________________________________ 129 4. Conclusão ____________________________________________________ 132 5. Referências Bibliográficas _______________________________________ 133 Considerações finais ________________________________________________ 135 20 1. Introdução A avaliação das concentrações de metais no meio ambiente é importante, pois os elementos não são biodegradáveis e causam danos à saúde devido à sua toxicidade. A ampla aplicação de metais pesados em diversos processos industriais e sua solubilidade em água torna elevada sua distribuição no meio ambiente (BORAHAN et al. 2021). Assim, essas espécies que são persistentes, causam danos a longo prazo aos organismos vivos (DING et al. 2022), alcançando o ser humano de diversas formas, entre elas, os alimentos. Metais em alimentos podem ser provenientes de diversas fontes antropogênicas como processos industrias de fundição, galvanoplastia, mineração e efluentes industriais ou advindos de fontes naturais. A ingestão oral é uma das principais formas de exposição dos seres humanos a metais e metaloides. Através do consumo de alimentos, haverá a exposição a elementos essenciais que são necessários para o processo metabólico do organismo e também elementos não essenciais, que não possuem nenhuma função conhecida ao organismo humano (INTAWONGSE, 2006). Dentre estes metais podemos citar cádmio, manganês, vanádio, níquel e cobalto em que o primeiro não possui nenhuma essencialidade conhecida ao organismo humano e os demais são considerados essenciais, porém sua falta e/ou excesso no organismo podem causar diversos danos. Os compostos de cádmio são classificados como carcinogênicos por agências reguladoras como a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer e Organização Mundial da Saúde, estando associado a câncer de pulmão, fígado e rim (WAALKES, 2003; IL'YASOVA et al. 2005; SHANMUGARAJ et al. 2019; Dos SANTOS et al. 2009;). As fontes de exposição ao cádmio são diversas, dentre as quais podemos destacar os processos industriais de produção de baterias, galvanoplastia e exposição a fumaça de tabaco (WAALKES, 2003; KASA et al. 2019). O manganês, por sua vez, apresenta essencialidade ao organismo e de forma semelhante a outros metais essenciais, tanto seu excesso quanto sua deficiência podem comprometer processos fisiológicos e bioquímicos. Pode ser encontrado em diversos alimentos, como chá, grãos, nozes e cereais, sendo essa a principal fonte de ingestão deste metal. É um oligoelemento que desempenha funções enzimáticas essenciais, já seu excesso pode causar danos ao sistema nervoso central, respiratório e cardíaco (DOBSON et al. 2004; GOUDA, 2014). O vanádio possui vários estados de oxidação, as formas tetravalente V(IV), e pentavalente V(V), são as dominantes em meio aquoso, sendo que V(V) é mais tóxico que V(IV). Fatores como pH, força iônica e potencial redox influenciam na coexistência destas espécies. Na natureza este elemento está presente em minérios junto com outros metais e 21 também a partir de ações humanas, como combustão de combustíveis fósseis e carvão mineral, além de seu uso em industrias de tintas, baterias de níquel-cádmio, entre outros. É facilmente absorvido e acumulado nos alimentos, podendo gerar efeitos tóxicos em humanos, animais e plantas (WADHWA, et al. 2013; ZEEB et al. 2014; ALI et al. 2020). A principal fonte de exposição ao cobalto é através da ingestão de alimentos, sendo um elemento essencial ao organismo presente na vitamina B12 e é encontrado também em suplementos alimentares. Sua deficiência no organismo pode causar anemia perniciosa, enquanto seu excesso pode causar problemas respiratórios, edemas, dermatites alérgicas e problemas gastrointestinais (LAWERYS et al. 1994; SIMONSEN et al. 2012; ARAIN et al. 2016). A presença do níquel no meio ambiente se dá através de fontes naturais e uma ampla variedade de fontes antropogênicas como queima de combustíveis fósseis, fabricação de ligas de aço e resíduos em efluentes (OLIVARES ARIAS et al. 2014; RAD et al. 2019). Uma exposição a níveis elevados pode causar dores de estômago, dermatite de contato e doenças do sistema respiratório como lesões pulmonares (KASPRZAK et al. 2003; ARPA et al. 2019; ERLUAS et al. 2020). Um dos problemas encontrados na determinação desses oligoelementos em algumas matrizes como alimentos é a baixa sensibilidade, já que em muitos casos, os níveis do analito são baixos para determinadas técnicas de detecção. Assim, é necessária uma etapa preliminar de pré-concentração para melhorar a sensibilidade. Logo, a melhora do limite de detecção, nestes casos, é resultado da combinação da técnica de detecção com a metodologia de pré- concentração escolhida para a extração do analito (AGUIRRE, 2019). Técnicas como a extração em fase sólida e a extração líquido-líquido convencionais podem ser substituídas por alternativas como a microextração em fase sólida (SPME), microextração em fase líquida (LPME) e extração no ponto nuvem (EPN) com objetivo de um menor uso de reagentes e solventes orgânicos e permitir a pré-concentração do analito. A partir destas técnicas, diversas variações já foram relatadas na literatura com o intuito sempre de melhorar a seletividade, sensibilidade e ampliar o número de amostras que podem ser analisadas (HAN et al. 2017; KASA et al. 2019; SOYLAK e YILMAR 2020). Técnicas de microextração geralmente serão combinadas com diferentes técnicas espectrométricas de detecção como ETAAS, FAAS, ICP- MS e ICP-OES, entre outras (AGUIRRE, 2019). A definição da técnica de detecção mais adequada para a análise depende, entre outros fatores, das características do analito, complexidade da matriz e volume de amostra que será analisada (MORTADA e AZOOZ, 2022). 22 O extenso uso de microextração em fase líquida como etapa de pré-concentração se deve a eficiência de extração para vários analitos, rapidez e relativo baixo custo, porém, como qualquer outra metodologia tem desvantagens, como o fato de ainda utilizar solventes orgânicos voláteis e altamente tóxicos (BORAHAN et al. 2021). Assim, métodos de microextração empregando sistema aquoso bifásico (SAB) são uma excelente alternativa para eliminar o uso de solvente orgânico, sendo uma técnica considerada verde, já que seus componentes são atóxicos ou pouco tóxicos e, além disso, as duas fases são majoritariamente formadas por água (ASSIS et al. 2020; DA SILVEIRA LEITE et al. 2020, VALADARES et al. 2018; HAMTA et al. 2017). Para a formação de um SAB é necessário a mistura de soluções aquosas de dois polímeros, ou um sal e um polímero, ou dois tipos de eletrólitos, ou um sal e um surfactante (PAN et al. 2020). Após um período de repouso, ocorre a separação de fases, em certas condições termodinâmicas de pressão, composição do sistema e temperatura (PAN et al. 2020). Variando-se a concentração de cada componente é possível modular a razão dos volumes entre as fases, possibilitando assim a utilização desta técnica em processos de pré-concentração (ASSIS et al. 2019). Os SAB´s formados por polímero/sal/água são amplamente utilizados para a separação/extração de íons metálicos (DA SILVA et al. 2006), já que possuem características de fases que permitem a concentração dos íons metálicos em uma determinada fase. Após a separação de fases nestes sistemas, a fase superior (FS) fica concentrada em polímero enquanto a inferior (FI) em sal. Assim, se íons metálicos são adicionados a este sistema, eles serão concentrados na FI onde suas interações são mais favoráveis (NEVES et al. 2020). A utilização de um agente extrator possibilitada a transferência do analito para a FS. Isso mostra as diferentes possibilidades de configurações que os SAB podem ser utilizados como técnica de extração para este tipo de analito. Além disso, tanto os polímeros quanto os sais utilizados possuem baixo custo, alta estabilidade e não são inflamáveis (GRABER et al. 2000; HAMTA et al. 2017; LIU et al. 2016; FIGUEREDO et al. 2021). Nos últimos anos, SAB´s formados por surfactante/sal/água também têm apresentado características interessantes para a extração de íons metálicos, como mostrado por Zhang e colaboradores que utilizaram um sistema formado por triton X-100 e sulfato de amônio para extração de tungstênio (VI) na fase inferior do sistema, rica em sal, sem uso de agente complexante (Zhang et al. 2016). Com o intuito de desenvolver metodologias de pré-concentração para a determinação de metais em alimentos, explorando a versatilidade dos sistemas aquosos bifásicos, este trabalho possui os seguintes objetivos: i. no capítulo I o objetivo é desenvolver uma metodologia de pré-concentração de cádmio e manganês na fase inferior do SAB formado por 23 polímero e sal, sem o uso de agente complexante; ii. no capítulo II o principal objetivo é a pré- concentração de vanádio na fase superior do SAB, rica em polímero, utilizando um agente complexante; iii. no capítulo III a finalidade é pré-concentrar cobalto e níquel simultaneamente na fase superior, utilizando um SAB formado por surfactante/sal/água na presença de um agente complexante. Para otimização das variáveis que afetam a partição dos analitos nos SAB´s foi utilizada análise multivariada, já que esta apresenta algumas vantagens como a possibilidade de estudar os efeitos da interação entre as variáveis, economia de tempo e redução de reagentes utilizados. As metodologias desenvolvidas foram aplicadas a amostras de alimentos. 24 2. Objetivos 2.1. Objetivo Geral O objetivo geral deste trabalho é o desenvolvimento de metodologias analíticas baseadas em sistemas aquosos bifásicos para pré-concentração de íons metálicos a partir de amostras de alimentos e determinação por espectrometria de absorção atômica com chama. 2.2. Objetivos Específicos ✓ No capítulo I o objetivo é desenvolver uma metodologia de pré-concentração de cádmio e manganês a partir de amostras de alimentos na fase inferior de um sistema aquoso bifásico, sem a utilização de um agente complexante; ✓ O capítulo II objetiva o desenvolvimento de um método analítico para pré- concentração de vanádio oriundo de amostras de alimentos na fase superior de um sistema aquoso bifásico, na presença de um agente complexante; ✓ O objetivo do capítulo III é pré-concentrar simultaneamente cobalto e níquel provenientes de amostras de alimentos na fase superior de um sistema aquoso bifásico, na presença de um agente complexante; ✓ Otimizar as metodologias através de análise multivariada; ✓ Incrementar a sensibilidade do espectrômetro de absorção atômica para estes analitos através da pré-concentração dos mesmos em sistemas aquosos bifásicos; ✓ Obter as características analíticas para todas as metodologias propostas; ✓ Aplicar as metodologias desenvolvidas em diversas amostras de alimentos. 25 3. Referencial Teórico 3.1. Metais em amostras de alimentos Alguns metais são considerados como oligoelementos por existirem em quantidades vestigiais em diversas amostras, sendo que no ambiente é proveniente principalmente de atividades agrícolas, industriais, mineração, domésticas e farmacêuticas e sua presença causa riscos e danos tanto ao ecossistema quanto a cadeia alimentar, interferindo nos processos fisiológicos, bioquímicos e moleculares de todos os organismos vivos (DASBASI et al. 2016; WERNER et al. 2018; SHANMUGARAJ et al. 2019). A presença de metais no solo tem aumentado de forma significativa nos últimos anos, sendo que, dentre os metais mais encontrados tem-se manganês, ferro, níquel e zinco que possuem essencialidade aos organismos vivos enquanto que outros como cádmio, chumbo, mercúrio e arsênio não apresentam nenhuma função essencial conhecida (SHANMUGARAJ et al. 2019). A ingestão via oral é uma das formas de exposição mais importante para os seres humanos de contaminantes potencialmente nocivos, incluindo metais ou metalóides. Através do consumo de alimentos há a exposição a elementos essenciais e não essenciais ao indivíduo (INTAWONGSE et al. 2006). A segurança alimentar é uma área de pesquisa que vem sendo cada vez mais explorada, porque além dos efeitos à saúde também interessa ao comércio internacional de alimentos (ZHANG et al. 2019). A presença de contaminantes nos alimentos ocorre devido a sua exposição ao solo e/ou ar contaminados, ou ainda através dos processos de produção, transporte e armazenamento, sendo que as atividades industriais, uso de pesticidas, fertilizantes, aditivos ilegais e medicamentos veterinários podem incrementar a presença de espécies tóxicas na cadeia alimentar causando riscos à saúde humana (SHANMUGARAJ et al. 2019; ZHANG et al. 2019). Os esforços para o monitoramento eficaz dos contaminantes nos alimentos tem sido feito por pesquisadores e por diversas organizações nacionais e internacionais com o intuito de desenvolver regulamentações de segurança alimentar para proteger os consumidores dos riscos à saúde causados por contaminantes e resíduos (ZHANG, et.al 2019). Entre os metais mais importantes de serem monitorados em alimentos estão os que foram estudados neste trabalho, como cádmio, Manganês, Vanádio, Cobalto e Níquel. 3.1.1. Cádmio O acúmulo de metais tóxicos, como cádmio, no meio ambiente tem sido alvo de preocupação já que causa problemas de poluição ambiental, deterioração de diversos 26 ecossistemas e seu acúmulo nos tecidos vivos ao longo da cadeia alimentar representa um sério risco à saúde (DASBASI et al. 2015). A presença de Cd no ambiente é persistente, uma vez que possui uma meia-vida relativamente longa, na faixa de 10 a 30 anos, sendo que sua presença é decorrente principalmente de atividades humanas como mineração, soldagem, refinaria e tabagismo (DASBASI et al. 2015; KASA et al 2019). A aplicação repetida de fertilizantes fosfatados é um contribuinte importante para o acúmulo gradual de Cd no solo ao longo do tempo. A migração deste contaminante para plantas ocorre através do solo e água contaminados, onde se acumula na parede celular e se deposita primeiramente nas raízes, onde a concentração do metal é maior que nas folhas (KASA et al 2019; DASBASI et al. 2015; KARAK et al. 2010; SHANMUGARAJ et al. 2019). Além disso, como o cádmio é um metal fitotóxico mesmo em baixas concentrações, a transferência do solo para a planta ocorre facilmente e seu acúmulo irá apresentar toxicidade tanto para as plantas quanto para toda a cadeia alimentar, sendo esta a principal fonte de contaminação por este metal nos alimentos (DASBASI et al.2015; KARAK et al. 2010; SHANMUGARAJ et al. 2019). Alguns metais apresentam essencialidade ao organismo em quantidades adequadas, porém metais como cádmio são tóxicos mesmo em pequenas quantidades e têm influência negativa em diversos processos biológicos, sendo os alimentos e a exposição à fumaça do cigarro as maiores fontes de contaminação nos seres humanos (WANG et al. 2020; DASBASI et al. 2015). Este elemento obteve classificação como cancerígeno pela Agência Internacional para Pesquisa do Câncer (IARC) e alguns estudos mostraram que sua presença em alimentos afeta a absorção de elementos importantes como zinco, cálcio e ferro, essenciais no combate à anemia (WAALKES et al. 2003; DOS SANTOS et al. 2009). Ele atua no organismo ligando- se ao grupo -SH de resíduos de cisteína presente nas proteínas, inibindo as enzimas –SH, além disso pode deslocar o zinco em enzimas inibindo sua atuação (DASBASI et al. 2015). Mesmo estando em pequenas quantidades em amostras de alimentos a ingestão prolongada leva a disfunção grave nos rins, fígado, causa hipertensão e diabetes e quando presente no organismo em doses elevadas pode afetar o sistema respiratório e até mesmo pode estar associado a doenças ósseas, além de ser carcinogênico, estando associado principalmente ao câncer de pulmão, rim e próstata (AFKHAMI et al. 2006; DASBASI et al. 2015; SHANMUGARAJ et al. 2019; WAALKES et al. 2003; IL´YASOVA et al. 2005). Como cádmio está presente nas amostras de alimentos em níveis vestigiais isso requer uma etapa prévia de preparação da amostra ou o uso de instrumentos com elevada sensibilidade para sua determinação (KASA et al 2019). 27 3.1.2. Manganês O manganês é um oligoelemento que possui essencialidade para a vida animal e para plantas, está presente nas células de todos os seres vivos em baixa concentração e sua deficiência em organismos como bactérias, mamíferos e plantas causam efeitos como diminuição na expectativa de vida e inibição de crescimento. Para o crescimento das plantas é essencial a presença de manganês e, então, sais desse elemento são adicionados ao solo com deficiência do mesmo, com isso, os alimentos são a principal fonte de manganês para humanos e nos produtos de origem vegetal é onde se encontra as maiores concentrações (LEMOS et al. 2009). A ingestão diária recomendada de manganês é de 1 a 5 mg através de alimentos como grãos integrais, legumes, nozes, amêndoas, frutas e chás que possuem altas concentrações deste elemento (KEMMIT et al. 2006; BARRETO et al. 2020). O manganês atua no organismo humano no sistema nervoso, no metabolismo e na mineralização óssea, sendo que sua falta ou excesso podem causar danos à saúde (KARAK et al. 2010; DOBSON et al. 2004). Uma exposição a níveis elevados deste metal pode acarretar prejuízos à saúde especialmente para gestantes e lactantes, onde o sistema nervoso central pode ser muito afetado. Náusea, dor de cabeça e bronquite são alguns exemplos de sintomas de pacientes com exposição crônica a Mn, além de estudos que o relacionam a doenças como esclerose lateral amiotrófica, Parkinson, Alzheimer, esquizofrenia e autismo (BARRETO et al. 2020). No caso do sistema nervoso central deve-se ter um maior cuidado ao considerar níveis elevados já que os efeitos tóxicos neste surgem em concentrações menores que nos demais sistemas citados acima, causando efeitos preocupantes uma vez que seus efeitos neuroquímicos ainda são pouco conhecidos (DOBSON et al. 2004). Com isso sua determinação em amostras de alimentos se torna tão importante. 3.1.3. Vanádio O vanádio é um elemento com abundância na crosta terrestre de cerca de 0,019%, e o segundo elemento de transição mais abundante na água do mar. Até antes dos anos 70, pouco era o interesse em pesquisas sobre o vanádio, porém a partir da compreensão da importância deste metal para algumas enzimas e no seu uso como catalisadores, muitos estudos começaram a ser publicados (PESSOA et al. 2015). Na área farmacêutica tem sido grande o interesse em estudos que mostram que vanádio pode agir com agente terapêutico para o tratamento de diabetes, atuando na diminuição de 28 glicose sanguínea. As formas tetravalentes V(IV), como sulfato de oxovanádio, as formas pentavalentes V(V), como o metavanadato de sódio e o pentóxido de vanádio, apresentaram redução nos níveis de glicose sanguínea em animais. Porém apesar do seu potencial para o tratamento da diabetes, ele foi estabelecido como poluente ambiental e tóxico aos seres humanos, provocando alterações fisiológicas e anatômicas quando administrado por via oral (BITTENCOURT et al. 2018). O vanádio possui diferentes estados de oxidação de -1 a +5, com as formas +4 e +5 sendo dominantes em amostras ambientais aquosas. Em pequena quantidade é um nutriente importante para alguns organismos, mas assim como outros íons de metais pesados, não é biodegradável e pode se acumular em certos organismos em níveis tóxicos. Os impactos fisiológicos e biológicos são dependentes de seu estado de oxidação, uma vez que V(V) é mais tóxico que V(IV), pois o íon vanadato (H2VO4 −) possui uma semelhança estrutural com os íons fosfato (H2PO4−) e o vanadato (VO43−), formado pela hidrólise de V2O5 em pH alto, inibindo as enzimas que processam o fosfato (PO43−) (ASADOLLAHI et al. 2010; ZEEB et al. 2014). A presença deste metal no meio ambiente pode ocorrer através do processo de combustão de combustíveis, atividades em indústrias de tingimento, cerâmica, tinta, catalisadores, fabricação de aço, ligas resistentes à temperatura, e na indústria do vidro. Os teores de vanádio no solo estão relacionados a sua presença em rochas, sendo a concentração de vanádio no solo cerca de 10 vezes mais que em plantas (PYRZYŃSKA et al. 2004; ASADOLLAHI et al. 2010; ZEEB et al. 2014). Estão presentes em baixas concentrações em diversas matrizes, como plantas, solo, água e alimentos. O metabolismo do sistema biológico pode ser prejudicado devido à ingestão excessiva de V no organismo, que cria efeitos adversos nas células, onde o fígado, rins, coração, pulmões e ossos são os mais afetados pela exposição, sendo assim, fundamental a sua determinação (EVANGELOU 2002; ALI et al. 2020; MORTADA et al. 2022). Assim, é de suma importância o desenvolvimento de metodologias analíticas para determinação do vanádio em alimentos. 3.1.4. Cobalto O cobalto ocorre naturalmente na terra e está presente em pequenas quantidades no solo, ar, água, plantas e, consequentemente na dieta humana. Em geral, a maior parte do Co ocorre em minérios de Cu e Ni, tornando o Co um subproduto da extração de outros metais, o que significa que é quase sempre um produto secundário ao Ni ou Cu, e raramente é o metal primário de interesse econômico (MUDD et al. 2013; MIRABI et al. 2017). Há séculos que o 29 cobalto é utilizado na produção de pigmentos, porém somente a partir do século XIX é que ele começou a ser utilizado na indústria de petróleo como catalisador, na fabricação de ligas e baterias (MUDD et al. 2013; KOOSHA et al. 2018; VERDIZADE et al. 2018). Sais de cobalto são usados na indústria de esmaltes e pigmentos, ocorre ainda, exposição a traços de cobalto na manipulação de cimento e também durante o polimento de diamantes com discos contendo cobalto (LAWERYS et al. 1994). É essencial ao organismo humano, cuja necessidade diária é de apenas alguns miligramas, estando presente na vitamina B12 envolvida na formação de glóbulos vermelhos, onde os níveis normais de íons Co (II) na urina e no sangue humanos são cerca de 1,0 e 0,18 μg L −1, respectivamente. Já a sua deficiência está associada a anemia perniciosa, distúrbios hepáticos, pancreáticos e do sistema nervoso e seu excesso causa sintomas tóxicos como vasodilatação, hipotireoidismo, neuropatia, deficiência auditiva ou visual e cardiomiopatia (SIMONSEN et al. 2012; ARAIN et al. 2016; MIRABI et al. 2017; ARPA et al. 2019; KOOSHA et al. 2018; ELIK et al. 2020). Para a população em geral, alimentos e bebidas representam a principal fonte de exposição ao cobalto, sendo que, ele é absorvido principalmente por via pulmonar e gastrointestinal. Devido a esses fatores relacionados à função nutricional e, principalmente, à toxicidade, a determinação de cobalto em amostras de alimentos é uma questão importante (LAWERYS et al. 1994). 3.1.5. Níquel Níquel é um metal de transição que possui cinco estados de oxidação. Ocorre naturalmente na crosta terrestre, podendo formar uma grande variedade de espécies diferentes, mas as mais comuns são com nox +2. É um metal traço, nutricionalmente essencial para várias espécies animais, microorganismos e plantas. É amplamente utilizado em aplicações industriais diversas, estando presente em combinação com outros metais como em ligas de ferro e de aço, na galvanoplastia, para colorir cerâmicas, em baterias, dispositivos eletrônicos, pesticidas, fertilizantes e herbicidas (OLIVARES ARIAS et al. 2014; RECLO et al. 2017; ERULAS et al. 2020; PEREIRA et al. 2020). Pode estar presente na atmosfera e em corpos aquáticos pelas atividades industriais de combustão de carvão e incineração de lixo (RECLO et al. 2020). Em quantidades elevados no organismo pode causar dores de estômago, doenças renais, cardiovasculares, dermatite de contato e doenças do sistema respiratório como lesões pulmonares (KASPRZAK et al. 2003; ARPA et al. 2019; ERLUAS et al. 2020). Por outro lado, nenhuma doença causada pela deficiência de níquel ainda foi identificada, com isso há muitos 30 estudos com foco na determinação de traços de níquel visando evitar os efeitos adversos da exposição (ERULAS et al. 2020). A exposição ao níquel é proveniente, principalmente, por ingestão de alguns alimentos como vegetais, e inalação, sendo que, o tabagismo pode aumentar ainda mais o níquel inalado (KASPRZAK et al. 2003). A presença de níquel em alimentos é comumente proveniente da sua presença natural no solo, uso de fertilizantes, herbicidas e também por atividades industrias. Pode-se também haver transferência de níquel para alimentos através de embalagens de enlatados, pois os recipientes de aço contem níquel na sua composição (PEREIRA et al. 2020). A ingestão de níquel na dieta pode variar bastante já que alguns fatores podem influenciar como, localização geográfica do alimento consumido, os componentes nutricionais de cada alimento, a quantidade de alimento de origem animal e vegetal consumida, poluição ambiental, bem como como a migração desse elemento durante o processamento e armazenamento dos alimentos, além dos diferentes utensílios de cozinha feitos de aço inoxidável (OLIVARES ARIAS et al. 2014). Portanto, devido ao risco à saúde humana que estes metais ocasionam, é necessário o desenvolvimento de metodologias analíticas para sua determinação em amostras de alimentos. Considerando que as concentrações destes analitos nestas amostras são muito baixas, há a necessidade que estas metodologias contemplem uma etapa de pré-concentração, para que os equipamentos de detecção possam medir com exatidão a concentração destas espécies. 3.2. Técnicas de pré-concentração Para o desenvolvimento e aplicação e métodos analíticos que visam a determinação de traços, o uso de metodologias de separação e pré-concentração são muito importantes. Estas etapas permitem a determinação de quantidades traço do analito em matrizes com diversos graus de complexidade. A expressão “análise de traços” é usualmente citada para descrever situações em que a quantidade de substância a ser detectada é muito pequena em relação a outros constituintes da amostra, ou quando a quantidade de um analito na amostra é suficientemente pequena dificultando a obtenção de resultados confiáveis, usando uma determinada técnica analítica (BEZERRA e FERREIRA, 2006). Apesar dos avanços no desenvolvimento de equipamentos analíticos altamente sensíveis, seletivos e com limites de detecção cada vez menores, muitas vezes a espécie de interesse está em concentração muito abaixo do limite de detecção (LD) da técnica empregada. Com a finalidade de melhorar o LD utiliza-se separação e pré-concentração do analito antes da 31 detecção, para este propósito diversas técnicas são utilizadas para tratamento de amostras, entre elas, as técnicas de precipitação, deposição eletroanalítica, troca iônica, extração líquido- líquido, extração em fase sólida, extração no ponto nuvem, entre outras (SOYLAK e YILMAR, 2020; BEZERRA e FERREIRA, 2006). Neste contexto, as técnicas como a microextração em fase sólida (SPME), microextração líquido-líquido (LPME) e extração no ponto nuvem (EPN) surgiram como alternativas às técnicas de extração em fase sólida e extração líquido-líquido convencionais para pré-concentração das espécies de interesse com menor impacto ambiental. A SPME se baseia na extração do analito da matriz em uma fase sólida feita de sílica revestida de material adequado para adsorção ou absorção do analito. Os componentes da amostra são particionados entre a fibra revestida e a matriz. Em seguida, o analito é eluido usando um solvente ou pelo uso de alta temperatura levando a liberação do mesmo. Dessa maneira pode ocorrer tanto a separação quanto a pré-concentração. Dentre os principais métodos de microextração em fase sólida podemos citar os aplicados por imersão direta (DI-SPME), headspace (HS-SPME), extração dinâmica em fase sólida (SPDE), extração sortiva em barra de agitação (SCSE), extração sortiva de disco rotativo (RDSE) (SOYLAK e YILMAR 2020). Já a LPME é baseada na extração do analito de um líquido de maior volume contendo o analito para um pequeno volume de outro líquido (SOYLAK YILMAR 2020). A microextração líquido-líquido é muito eficiente na separação das espécies de interesse, sendo que o funcionamento básico desta técnica é baseado nas taxas de dispersão dos componentes entre dois líquidos essencialmente imiscíveis, assim o analito presente na solução que contém a amostra é transferido para a outra fase, e os demais componentes da matriz permanecem na solução da amostra ou vice-versa (SOYLAK e YILMAR 2020). Neste contexto, as técnicas de microextração em fase líquida (LPME) para extração e pré-concentração são amplamente estudados por superar a excessiva geração de resíduos tóxicos e também possibilitar o tratamento da amostra para melhora da sensibilidade na detecção. Entre as variações da técnica de LPME podemos destacar a microextração em gota única (SDME), microextração líquido- líquido dispersiva (DLLME) e microextração por gota orgânica suspensa solidificada (SFODME) (HAN et al. 2017; KASA et al. 2019). Na figura 1, é apresentado um esquema geral de pré-concentração usando microextração líquido-líquido dispersiva. Com a adição de todos os componentes, solvente, extrator e dispersor a amostra irá turvar (A) e após agitação e centrifugação ocorre a separação de fases. 32 Figura 1- Esquema de um sistema de microextração em fase líquida: (A) sistema contendo a amostra, sendo adicionado complexante, agente extrator e dispersor (B) extração e pré- concentração do analito na gota formada na fase inferior do tubo. Fonte: próprio autor Apesar da redução de resíduos ser uma realidade nas técnicas citadas acima, os resíduos gerados ainda são tóxicos. Desta forma, é cada vez mais urgente a necessidade de desenvolvimento de metodologias de baixo custo, sem utilização de solventes tóxicos e que sejam eficientes para separar e pré-concentrar o analito de interesse. Na extração no ponto de nuvem (EPN) surfactantes são utilizados para a formação de uma pequena fase e, consequentemente, pré-concentrar os analitos, sendo considerada uma alternativa muito promissora para substituir os sistemas de extração convencionais, já que utiliza solução aquosa de surfactante evitando o uso de solventes tóxicos (WERNER et al. 2018). Na figura 2 é possível observar um esquema de uma extração no ponto nuvem, onde ocorre primeiro a formação de micelas (A) e quando o ponto nuvem é atingido há a separação de fases e as micelas se concentram na fase inferior do tubo (B). EPN tem sido amplamente utilizada para pré-concentração de íons metálicos através da formação de quelatos hidrofóbicos e consequente partição desses para as micelas formadas pelo surfactante (AFKHAMI et al. 2006). Porém, a EPN apresenta desvantagens como a de necessitar de ligantes altamente hidrofóbicos para obter uma transferência quantitativa dos analitos para a fase micelar, além disso é necessário aumentar a temperatura do sistema para a formação da fase (BEZERRA e FERREIRA, 2006). 33 Figura 2 - Esquema geral de sistema de extração no ponto nuvem: (A) formação das micelas do analito e surfactante (B) as micelas se depositam no fundo do tubo, ocorrendo a pré- concentração. Fonte: próprio autor Uma alternativa interessante são os sistemas aquosos bifásicos (SAB´s), os quais são formados majoritariamente por água e possuem duas fases em equilíbrio à temperatura ambiente. Estas fases possuem propriedades químicas que podem ser moduladas de acordo com a aplicação. Assim, esta técnica surge como alternativa viável para extração e pré-concentração de íons metálicos presentes em amostras de alimentos. 3.3. Sistema Aquoso Bifásico (SAB) 3.3.1. Conceitos e propriedades Em 1896, em Delft, na Holanda, enquanto estudava o comportamento coloidal de partículas de amido, Beijerinck descobriu acidentalmente que um sistema de duas fases é formado quando se mistura soluções aquosas de amido e ágar ou gelatina e ágar, observando que, em uma determinada concentração, estas misturas ficavam turvas e que depois de um tempo em repouso havia a formação de um sistema bifásico (VAN BERLO et al. 1998; GRILO et al. 2016). Contudo, foi apenas em 1958 que Albertsson publicou um estudo em que este 34 sistema bifásico foi usado para a extração de biomoléculas, onde foi avaliado o comportamento de SAB´s formados por polímero/polímero/água e polímero/sal/água em que ficou claramente demonstrado o potencial desta técnica para separação de analitos biológicos (ALBERTSSON et al. 1958). Daí em diante, um grande número de pesquisas sobre SAB´s têm sido publicado, focando em caracterização de sistemas, construção de diagramas de fases, entendimento dos mecanismos de separação para diferentes sistemas, partição de diversos analitos e na aplicação para extração e pré-tratamento de amostras em técnicas analíticas (PEREIRA et al. 2020). Um SAB poderá se formar quando são misturadas soluções aquosas de dois polímeros, ou um sal e um polímero, ou dois tipos de eletrólitos, ou um sal e um surfactante, desde que se alcance determinadas condições termodinâmicas, ou seja, uma faixa específica de temperatura, pressão e composição do sistema. Ultimamente novos componentes formadores de fase estão ganhando espaço como surfactantes (PAN et al. 2020), líquidos iônicos (GONZÁLEZ-AMADO et al. 2020), álcoois e ácidos orgânicos (GRILO et al. 2016). A combinação de diversos componentes possíveis para formação de um SAB mostra o quanto este é um sistema versátil e por isso tem ganhado destaque como uma alternativa muito viável para extração de corantes em matrizes aquosas (BORGES et al. 2016), biomoléculas (enzimas, proteínas, lipídios de membrana, anticorpos) (FAKHARI et al. 2017) e íons metálicos (DE LEMOS et al. 2012). Considerando um SAB formado por um polímero, sal e água, a partir de uma composição global específica, que é comumente apresentada em porcentagem massa/massa (%m/m), tem-se duas fases em equilíbrio, onde uma fase é rica em polímero e a outra fase é rica em sal, sendo que em ambas a água é o componente majoritário (DA SILVA et al. 2006; ASSIS et al. 2019; DA SILVA GONÇALVES et al. 2018; HAMTA et al. 2017). Assim, temos no SAB uma técnica de extração líquido-líquido que não utiliza solventes orgânicos, diferentemente da extração líquido-líquido convencional, causando baixo impacto ambiental, já que água é predominante no sistema e os demais componentes não são tóxicos ou inflamáveis e em muitos casos biodegradáveis e recicláveis (ASSIS et al. 2020; DA SILVEIRA LEITE et al. 2020, VALADARES et al. 2018; HAMTA et al. 2017). Além disso, outras vantagens como baixo custo, simplicidade, baixa tensão interfacial, possibilidade de aplicação em larga escala e em pré-concentração, explicam o motivo da crescente utilização desta técnica (ASSIS et al. 2020). Para uma determinada composição global, um sistema formado por polímero e sal (% m/m), como mostrado na figura 3, onde os constituintes do sistema são polietileno glicol 4000 g mol-1 (PEG4000), sulfato de sódio e água, a fase superior (FS) será rica em polímero e a fase inferior (FI) será rica em sal, sendo a água o componente majoritário em ambas. 35 Figura 3 - Parâmetros termodinâmicos de um SAB formado por PEG4000, sulfato de sódio e água a 25ºC. Fonte: próprio autor O diagrama de fases mostrado na figura 4 está representando a composição das fases de um SAB em equilíbrio termodinâmico, onde o gráfico é um diagrama de fases retangular em que a abscissa representa a concentração de eletrólito e a ordenada a concentração do polímero. Nota-se no diagrama a presença da linha binodal que separa a região em que o sistema é bifásico da região onde é monofásico, sendo que esta linha varia em função da natureza do eletrólito, tipo e massa molar do polímero, pH e temperatura. Os métodos mais utilizados para determinação da linha binodal é a titulação turbidimétrica e análise de composição das fases (DA SILVA et al. 2006). Para os estudos de partição é fundamental o seu uso como ferramenta para o desenvolvimento de um procedimento de extração e auxilio na compreensão dos fatores que governam a partição dos componentes nos SAB (DA SILVA et al. 2006). 36 Figura 4 - Diagrama de fase de um SAB formado por polímero + eletrólito + água expresso em coordenadas retangulares. Fonte: próprio autor Outra variável importante que pode ser observada na figura 4 é a linha de amarração (LA), que para determinada composição global fornece qual a composição de cada fase no equilíbrio, onde CFS é a composição da fase superior e CFI é a composição da fase inferior. Em qualquer ponto de uma mesma linha de amarração as propriedades intensivas (densidade, condutividade, composição, etc.) das fases superiores entre si e inferiores entre si serão idênticas, e as propriedades extensivas (volume, massa, etc.) diferentes (DA SILVA et al. 2006; GAMA et al. 2018). Assim, para qualquer ponto global preparado sob a mesma LA, as composições de fase superior serão idênticas, o mesmo acontece para a fase inferior; já a razão mássica entre as fases irá variar à medida que deslocamos sobre a LA. Em linhas de amarração diferentes, quanto maior o comprimento da linha de amarração (CLA) maior será a diferença entre as propriedades termodinâmicas das fases, sendo que os valores de CLA diminuem até o ponto crítico (ponto teórico), onde as composições de fase tornam-se iguais (GAMA et al.2018). O CLA é um parâmetro calculado em função da concentração dos componentes em cada fase, como indicado na equação 1. 𝑪𝑳𝑨 = [( 𝑪𝑷𝑭𝑺 - 𝑪𝑷𝑭𝑰)𝟐 + (𝑪𝑺𝑭𝑺 − 𝑪𝑺𝑭𝑰)𝟐]1/2 Equação 1 Onde, 𝐶𝑃𝐹𝑆 e 𝐶𝑃𝐹𝐼 representam a concentração do polímero nas fases superior e inferior e 𝐶𝑠 𝐹𝑆 e 𝐶𝐹𝑆𝐼 representam a concentração de sal nas fases superior e inferior, respectivamente. Com 37 aumento da CLA aumenta-se a diferença de composição entre as fases tornando a extração ou partição do soluto mais eficiente, uma vez que cada fase estará mais enriquecida em um dos componentes do sistema (DA SILVA, 2006). Os SAB´s possuem características que os enquadram dentro de alguns princípios da química verde. Assim, esta técnica está presente em diversos estudos que visam o desenvolvimento de metodologias para diminuir a produção e, consequentemente, o descarte de resíduos tóxicos ao meio ambiente e a saúde, atendendo assim ao aumento da rigidez das legislações ambientais. Neste contexto, os SAB´s além de serem consideradas uma metodologia “verde” também são economicamente atrativas (DA SILVA et al. 2006). Como os SAB´s têm demonstrado um grande potencial para extrair de forma seletiva íons metálicos, essa técnica tem sido muito estudada e tem despertado cada vez mais o interesse dos pesquisadores desta área (DA SILVEIRA LEITE et al. 2020). 3.4. Extração e pré-concentração de íons metálicos em SAB A determinação de metais é muito importante do ponto de vista da saúde e do meio ambiente, por isso vários métodos tem sido desenvolvidos visando a determinação destes em diversas amostras (HAMTA et al. 2017). Para esta finalidade os SAB´s tem ganhado espaço por serem considerados sistemas que se encaixam nos princípios de química verde, com a possibilidade de aplicação para extração de metais em hidrometalurgia, mineração e biorremediação ambiental mostrando que é uma ferramenta poderosa e eficiente para extração seletiva de íons metálicos (PEREIRA, 2020). Os SAB´s foram descritos pela primeira vez para aplicação na extração de metais em 1984, em sistemas formados por polímero, sal e água (ZVAROVA et al. 1984). Recentemente, a exploração destes sistemas para a pré-concentração, separação e recuperação dos íons metálicos têm ganhado destaque tanto para aplicação em escala laboratorial como em aplicações industriais (SHIBUKAWA et al. 2001; RODRIGUES et al. 2012). No SAB a tensão interfacial é bem menor que em um sistema líquido–líquido tradicional, favorecendo a dispersão de uma fase na outra e incrementando a extração (GRILO et al. 2016). Além da baixa tensão interfacial, outro fator importante é a possibilidade de modulação da concentração dos componentes formadores do sistema, aumentando ou diminuindo a diferença entre as propriedades físico- químicas das FS e FI, otimizando o processo de separação/extração (VIEIRA et al. 2019; PEREIRA et al. 2020). A pré-concentração de íons metálicos com o uso do SAB é possível 38 através da alteração dos volumes de cada fase do sistema para possibilitar o enriquecimento de uma das fases com o analito (PEREIRA et al. 2020). Os SAB´s formados por polímero/sal são os mais utilizados para a separação/extração de íons metálicos, já que possuem vantagens como baixa tensão interfacial entre as fases e elevada seletividade. O polietileno glicol (PEG) é comumente utilizado como polímero formador de fase devido ao seu baixo custo, alta estabilidade e por não ser inflamável, além da possibilidade de trabalhar em uma ampla faixa de concentrações, pHs e temperaturas. (GRABER et al. 2000; HAMTA et al. 2017). Para a partição de íons metálicos em sistemas formados por PEG/Sal, são estudados fatores como concentração e massa molecular de PEG, tipo de sal e suas concentrações, pH do sistema, temperatura, presença de espécies neutras ou carregadas no sistema, concentração e tipo de extrator e as propriedades das espécies metálicas extraídas como; grau de hidratação, carga, dimensão, entre outros, estes são fatores muito importantes para definição das melhores condições para se alcançar altas porcentagens de extração (BULGARIU e BULGARIU 2008; GRABER et al. 2000). A fase rica em PEG não consegue extrair de forma significativa a maioria dos íons metálicos sem a presença de um agente extrator, pois estes tendem a migrar preferencialmente para fase rica em eletrólito (BULGARIU e BULGARIU 2008; DE OLIVEIRA et al. 2017), já que nesta fase ocorre uma forte interação do tipo íon-íon, entre o ânion do sal e os íons metálicos, resultando na formação de um complexo hidrofílico na fase inferior do SAB (DE OLIVEIRA et al. 2017). Haverá também interações do tipo íon-dipolo entre íon metálico com as moléculas de água, as quais estão em maior concentração na FI (MARCUS, 1991). Para que seja possível a extração do íon metálico na fase superior a presença de agentes extratores, solúveis na fase polimérica, tem sido amplamente utilizada. Após a adição do extrator ao SAB há uma competição entre o extrator e o ânion do sal para complexar o íon metálico, no entanto, quando o complexo é formado ele é transferido para a fase superior, onde suas interações são mais favoráveis, o que desloca o equilíbrio favorecendo a formação de mais complexo (DE OLIVEIRA et al. 2017). Estudos mostram extratores usados com sucesso para este fim, como o trabalho de GAMA (2018) que utilizou iodeto para pré-concentrar cádmio na fase polimérica, entre outros (GAMA, 2018). Os SAB´s tem sido usados também para desenvolver metodologias de especiação química como foi mostrado em estudo relatados na literatura, como exemplos: um sistema formado por L64 + Li2SO4 + H2O utilizado para especiação de Cr(III) e Cr(VI), onde o Cr(III) é extraído para a fase inferior do sistema (fase rica em eletrólito) e o Cr(VI) é extraído na fase superior ( fase rica em polímero) na presença 39 do extrator 1,5-difenilcarbazida (PATRÍCIO et al. 2016); a especiação de Arsênio através do sistema L64 + Na2SO4  + H2O, onde foi possível observar que na presença do extrator ditiocarbamato de amônio e pirrolidina (APDC) o As (III) é extraído na fase superior e enquanto As(V) permanece na fase inferior (ASSIS et al. 2019). Rodrigues (2012) e colaboradores fizeram uso de sistema em fluxo combinado com SAB para determinação de cobalto, demonstrando o grande potencial da técnica para uso em tratamento de amostras complexas com analitos em quantidades traço. Na tabela 1 estão listados alguns trabalhos que utilizaram sistemas aquosos bifásicos para extração de diversos íons metálicos. Tabela 1 - Publicações cientificas para determinação de metais usando sistema aquoso bifásico (SAB) Amostra Analito Sistema Técnica Referência Água As3+ Pré-concentração HG-ICP- OES ASSIS et al. 2019 Água Y Extração ICP-OES DA SILVEIRA LEITE et al. 2020 Baterias Co2+ e Ni2+ Extração FAAS VALADARES et al. 2018 - V2+ e Mo2+ Extração ICP-AES PAN et al. 2020 Leite Cd2+ Pré-concentração FAAS GAMA et al. 2018 - Hg2+, Zn2+ e Co2+ Extração FAAS HAMTA et al. 2017 - Hg2+, Bi3+, Zn2+, Cd2+ e Pb2+ Extração FTIR BULGARIU et al. 2008 - Mn2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Cd2+ e Li+ Extração FAAS SHIBUKAWA et al. 2001 Minério Cu2+ Extração FAAS DE LEMOS et al. 2012 - Cr3+ e Cr6+ Especiação FAAS PATRÍCIO et al. 2016 Baterias Cd2+ Extração FAAS LACERDA et al. 2009 Baterias Zn2+ e Mn2+ Extração FAAS DA SILVEIRA LEITE et al. 2019 Resíduos domésticos e industriais Hg2+ Extração FAAS DA CUNHA et al. 2016 _ Co2+, Ni2+ e Cd2+ Extração FAAS RODRIGUES et al. 2013 A tabela 1 mostra a potencialidade dos SAB para aplicação na extração de íons metálicos, já que diversos íons diferentes foram extraídos provenientes de matrizes com 40 diferentes composições. Exceto para determinação de cadmio em Leite, estes sistemas ainda não foram aplicados para tratamento de amostras de alimentos para determinação de íons metálicos nestas matrizes. Em um sistema formado por surfactante/sal, características semelhantes de sistemas aquosos bifásicos formados por polímero/sal se aplicam. A separação de fases em um SAB formado por surfactante e sal é um processo termodinâmico complexo afetado pela temperatura, tipo e concentração de sal, tipo e concentração de surfactante (LIU et al. 2016; FIGUEREDO et al. 2021). Assim, para estes sistemas, uma fase ficará enriquecida em surfactante e a outra em sal, possibilitando a aplicação na extração de íons metálicos. Uma das técnicas mais utilizadas para detecção de metais é a espectrometria de absorção atômica, já que possui vantagens como baixo custo de manutenção e boa exatidão. 3.5. Espectrometria de Absorção Atômica com chama A espectrometria de absorção atômica (AAS) se baseia na absorção de radiação eletromagnética por um determinado analito na forma atômica produzindo um sinal analítico que será proporcional à sua concentração. Foi descrita pela primeira vez para análise química em 1955 por Alan Walsh e, desde então, as aplicações do AAS têm sido amplas e abrangem diversos tipos de amostras, como biológicas, ambientais, de alimentos, etc. (WU et al. 2009). O espectrômetro de absorção atômica é um equipamento que permite a análise quantitativa de elementos metálicos em soluções líquidas, gasosas e sólidas. Os componentes básicos de um espectrômetro incluem fonte de radiação, sistema de atomização, conjunto monocromador, detector e processador como mostrado na figura 5. Figura 5 - Diagrama de um espectrômetro de absorção atômica com chama. Fonte: próprio autor 41 Na fonte de radiação ocorre a excitação do elemento de interesse que é capaz de emitir/absorver radiação nas regiões visível e ultravioleta do espectro eletromagnético. O atomizador é uma parte fundamental da AAS, pois neste dispositivo serão gerados os átomos gasosos no estado fundamental, que absorverão a radiação de comprimento de onda característico proveniente da fonte de radiação, e, consequentemente, ser determinada a concentração do elemento de interesse. Neste trabalho, o atomizador utilizado é uma chama. No monocromador ocorre a separação da linha espectral de interesse das outras linhas emitidas pela fonte de radiação. O sistema de detecção consiste de um amperímetro analítico, ou seja, um dispositivo capaz de medir a corrente proveniente da fotomultiplicadora que converte radiação eletromagnética em corrente elétrica. Dentre as técnicas utilizadas para detecção e separação de analitos inorgânicos na determinação de metais vestigiais em diversas amostras, usando inclusive técnicas de microextração, a espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS) possuem vantagens como robustez, baixo custo, alta precisão e exatidão e facilidade de operação, sendo usada de forma rotineira nos laboratórios de análise de metais (KASA et al. 2019). Uma desvantagem associada a técnica é que os limites de detecção são altos, fator que é atribuído à baixa eficiência de amostragem devido ao emprego da nebulização pneumática, onde menos de 10% da amostra aspirada chega à chama, além do curto tempo que a amostra fica no caminho ótico diminuindo a eficiência de absorção de radiação (WU et al. 2009). Para superar estes problemas, procedimentos de pré-tratamento da amostra como digestão, separação e pré-concentração tem sido aplicados para a determinação de metais pesados em quantidades traço (HAN et al. 2007). As técnicas de análise multivariada têm sido extensamente utilizadas na otimização de metodologias analíticas, já que possibilita a diminuição do número de experimentos e a obtenção das condições ótimas com mais exatidão. 3.6. Otimização multivariada O uso de otimização univariada ou multivariada na otimização visa melhorar o desempenho do método através da definição dos valores ótimos de cada fator que influencia no sistema estudado, garantindo maior sensibilidade e o alcance das melhores características analíticas. Denominamos otimização univariada o estudo de um fator por vez e sua avaliação de forma individualizada, ou seja, avalia-se um fator enquanto os demais são mantidos constantes. Uma desvantagem deste tipo de otimização é que pode haver falhas quando existir dependência dos níveis de uma ou mais variáveis entre si. Mais recentemente a otimização 42 multivariada tem ganhado cada vez mais espaço no desenvolvimento de metodologias analíticas, já que possui muitas vantagens como número reduzido de experimentos, menor gasto de reagentes e de tempo, e por ser uma ferramenta que utiliza modelos matemáticos para estabelecer a relevância e a significância estatística dos efeitos dos fatores estudados, além de ser possível avaliar se a interação entre as variáveis é efetiva, além de permitir a otimização simultânea dos fatores (TARLEY et al. 2009 et al. NOVAES, 2017). 2.6.1 Metodologia de superfície de resposta O uso de metodologia de superfícies de resposta como ferramenta para otimização de experimentos tem ganhado espaço porque é eficiente e permite o estudo detalhado da capacidade do sistema de interesse. Além disso, as superfícies ilustram graficamente a relação entre as variáveis experimentais. Pode ser definida como uma combinação de técnicas de planejamentos experimentais que se baseia no ajuste de modelos matemáticos a partir de uma determinada matriz experimental com o intuito de verificar o comportamento dos dados. É uma ferramenta muito utilizada para quantificar e interpretar as relações entre as respostas e os efeitos dos fatores estudados (SHARMA et al. 2009; NOVAES, et al. 2017). Para uma descrição correta de dados que apresentam curvatura o planejamento experimental usado deve estudar todas as variáveis em no mínimo três níveis através de matrizes que permitem o ajuste de funções de segunda ordem. Os planejamentos experimentais mais usados para o ajuste de funções quadráticas são: Box-Behnken, Composto Central e matriz de Doehlert (NOVAES et al. 2017). A otimização multivariada pode ser realizada usando planejamentos experimentais de dois tipos: matriz de primeira e segunda ordem. Matriz de primeira ordem podem ser descritos de acordo com a equação 2: Y= a1 + b1A + c1B + d1AB Equação 2 Onde Y é a resposta experimental, A e B representam as variáveis a serem otimizadas, a1 é um termo independente, b1 e c1 coeficientes dos termos lineares e d1 é o coeficiente do termo de interação. Já as matrizes de segunda ordem são descritas pela equação 3: Y = a2 + b2A + c2B + d2A2 + e2B2 + f2AB Equação 3 43 Onde Y representa a resposta experimental, A e B representam as variáveis a serem otimizadas, a2 é um termo independente, b2 e c2 são coeficientes dos termos lineares, d2 e e2 são coeficientes dos termos quadráticos e f2 é o coeficiente do termo de interação (FERREIRA et al 2002). Para modelos quadráticos, o ponto crítico pode ser caracterizado como máximo, mínimo ou sela como mostrado na figura 6. 44 Figura 6 - Superfícies de resposta e curvas de níveis (a) com ponto máximo, (b) com ponto mínimo e (c) com ponto de sela. Fonte: Novaes et al. 2017 a b c 45 Na figura 6a está representada uma superfície onde o ponto de máximo localiza-se dentro da região experimental estudada. A figura 6b apresenta uma superfície com um ponto de mínimo e a figura 6C exibe uma superfície com ponto de sela. O ponto de sela é um ponto de inflexão entre um máximo relativo e um mínimo relativo. Se o objetivo é obter uma resposta máxima ou mínima para um sistema estudado, as coordenadas do ponto de sela não servem como valores ótimos (BEZERRA et al. 2008). 3.6.1. Matriz Doehlert A escolha do tipo de planejamento que será utilizado depende das condições experimentais e da finalidade a que se destina. Os planejamentos de segunda ordem apresentam vantagens porque além de relacionar as influências das variáveis na resposta também permite que a função de resposta obtida seja otimizada. A matriz Doehlert é um planejamento de segunda ordem, que permite a identificação de pontos críticos (máximo, mínimo e pontos de sela) em cada etapa do processo de otimização (FERREIRA et al. 2002). A matriz Doehlert é utilizada na química analítica para otimização de metodologias, tendo vantagem frente a outros planejamentos experimentais como maior eficiência e necessidade de menor número de experimentos. Apresentado em 1970 por David H. Doehlert, ela é uma matriz experimental de segunda ordem bastante atrativa e útil que se caracteriza por uma distribuição uniforme de pontos por todo o espaço experimental, com os pontos experimentais igualmente espaçados em círculos para duas variáveis, esferas para três variáveis ou hiperesferas concêntricas para mais de três variáveis, o que acentua a uniformidade das variáveis estudadas no domínio experimental com a necessidade de poucos pontos experimentais para que tenha resultados com alta eficiência. As características gerais para este tipo de matriz podem ser enumeradas da seguinte forma: ✓ O número de experimentos é dado por N = k 2 + k + cp, onde k é o número do fator e cp é o número do ponto central que é replicado para validação do modelo por meio de uma estimativa da variância experimental, onde um mínimo de três fatores é assegurado para cada nível; ✓ Distribuição uniforme dos intervalos entre os níveis; ✓ Uso de pontos adjacentes anteriores para deslocamento da matriz experimental para outra região; 46 ✓ O estudo de cada fator se dá em número diferente de níveis, sendo bastante útil quando se deseja estudar uma variável em um número maior ou menor de níveis, ou até mesmo quando sem tem limitação instrumental ou de disponibilidade de material para uma determinada variável. Por exemplo, em um caso de dois fatores, pode-se estudar um em 5 níveis e o outro ser estudado em 3, onde critérios podem ser usados para atribuir estes fatores, desta forma é possível obter maiores informações sobre os fatores mais significantes. De maneira geral o fator que exibe maior efeito no sistema é preferencialmente escolhido como fator de cinco níveis para que se obtenha o máximo de informações sobre o sistema estudado; A matriz de Doehlert para duas variáveis é representado por um ponto central cercado por seis pontos formando um hexágono regular, já para três variáveis é formado um cuboctaedro que pode ser visto de diferentes maneiras dependendo de sua projeção plana (BEZERRA et al. 2008; TARLEY et al. 2009). Na figura 7 é possível ver estas representações graficamente. Figura 7- Desenho do planejamento Doehlert para duas variáveis (I) e para três variáveis (II). Fonte: Bezerra et al. 2008 Para se determinar condições ótimas utiliza-se equações de regressão com as apresentadas nas equações 4, 5 e 6. Y =β0 + β1X1 + β2X2 + β11 X12 + β22X2 +β12 X1X2 Equação 4 47 𝝏𝒚𝝏𝒙𝟏 = β 1 + 2 β 11X1 + β12 X2 = 0 Equação 5 𝝏𝒚𝝏𝒙𝟐 = β 12+ 2 β 22X2 + β12 X1 = 0 Equação 6 As equações acima são funções quadráticas obtida para otimização de duas variáveis, onde as equações 5 e 6 são usadas para calcular os valores de X1 e X2, sendo possível calcular as coordenadas do ponto crítico que para modelos quadráticos pode ser caracterizado como máximo, mínimo ou sela. As coordenadas do ponto crítico podem ser calculadas através das primeiras derivadas da função matemática que descreve a superfície de resposta em relação a cada variável e igualando-as a zero. É possível também que a superfície quadrática indique um ótimo localizado fora da região estudada indicando a direção no qual o planejamento deve ser deslocado, se possível (NOVAES et al. 2017). A primeira aplicação de matriz Doehlert em química analítica foi reportada em 1989 para amostras de medicamentos em uma metodologia de separação e detecção em cromatografia líquida de alta eficiência (HU et al. 1989). Posteriormente muitos trabalhos têm usado otimização multivariada para desenvolvimento de metodologias usando sistema aquoso bifásico, como demonstrado em estudo da partição de rênio e molibdênio (MARUCHI et al. 2019), extração de ítrio (DA SILVEIRA LEITE et al. 2020), partição de ácido acetilsalicílico e ácido salicílico (VIEIRA et al. 2019), entre outros. 3.6.2. Matriz Box-Behnken O planejamento Box-Behnken para três fatores consiste em um desenho esférico e giratório, onde todas os fatores são estudados em três níveis e o número de experimentos necessários para a obtenção do modelo é definido como: N = 2k (k − 1) + Co Equação 7 Onde k é o número de fatores e Co é o número de pontos centrais. (SOUZA et al. 2005; FERREIRA et al. 2019). Pode também ser considerado como três experimentos fatoriais 22 interligados e um ponto central (SOUZA et al. 2005). Na figura abaixo é possível observar sua representação gráfica que pode ser vista de duas formas: (i) um cubo que consiste no ponto 48 central e nos pontos médios das arestas, como pode ser observado na figura 8a, e uma figura de três experimentos fatoriais 22 interligados e um ponto central, como mostrado na figura 8b. Figura 8 - Projeto Box-Behnken. a) o cubo para BBD b) planejamento fatorial 2 2 interligados Fonte: SOUZA et al. 2005 Quando se compara projeto Box-Behnken com outros projetos de superfície de resposta (composto central, matriz de Doehlert e projeto fatorial completo de três níveis), ele e matriz Doehlert se mostram mais eficientes, além disso em uma matriz Box-Behnken não são avaliadas condições extremas, ou seja, não há combinações em que todos os fatores estão em seus níveis mais altos ou mais baixos (FERREIRA et al. 2007). 49 4. 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Ainda na fase de otimização, as melhores condições foram o comprimento da linha de amarração = 53,3%m/m; razão de massa entre as fases inferior e superior = 0,0290; e tempo de extração = 18hs. O método alcançou valores de LD (0,450 µg kg-1 para Cd (II) e 6,40 µg kg-1 para Mn (II)), LQ (1,50 µg kg-1 para Cd (II) e 21,0 µg kg-1 para Mn (II)) e fator de enriquecimento (16 para Cd (II) e 45 para Mn (II)) adequados para determinar os dois analitos em amostras de alimentos. O desvio padrão relativo intra e inter-dia variou de 3,28 a 4,37% e de 5,05 a 6,60% para Cd (II) e Mn (II), respectivamente. A análise da amostra certificada de folhas de pinheiro (NIST 1575a) exibiu uma recuperação de 98,2% para cádmio, e a amostra certificada de folhas de maçã (NIST 1515) apresentou recuperação de 99,2% para manganês, mostrando alta exatidão. O método foi aplicado a amostras de chá verde e café solúvel, e os testes de recuperação obtiveram resultados variando de 94 a 110%. Portanto, a metodologia proposta é eficiente e sem o uso de um complexante, sendo uma alternativa altamente exata e ambientalmente segura para a determinação de traços de metal em amostras de alimentos. Palavras-Chave: sistema aquoso bifásico; cádmio; manganês; matriz Doehlert; pré- concentração; amostras de alimentos. 58 1. Introdução Alguns metais são essenciais para os organismos vivos em concentrações muito baixas (por exemplo, manganês), enquanto outros (por exemplo, cádmio) são tóxicos mesmo em níveis traços e têm influência direta e adversa em vários processos biológicos (DAŞBAŞI et al. 2015). O cádmio é um metal tóxico que pode se acumular no corpo e levar ao aumento do risco de doenças como osteoporose, problemas renais e câncer (IL´YASOVA et al. 2005; WALL et al.2003; KASA et al. 2019). A maior fonte de exposição ao cádmio, exceto para os fumantes, é a ingestão de alimentos, onde a contaminação ocorre principalmente pelo consumo de produtos agrícolas devido ao uso de fertilizantes e ao fato de o cádmio no solo se acumular nas plantas (DASBASI et al. 2015; WANG et al. 2020). O manganês, por outro lado, é essencial para os organismos, atuando no sistema nervoso, no metabolismo e na mineralização óssea. No entanto, a exposição prolongada pode causar alterações importantes no sistema nervoso central, levando a doenças como Alzheimer e Parkinson, entre outras (DOBSON et al. 2004; BARRETO et al. 2020). Assim, é especialmente importante quantificar esses metais em amostras de alimentos. A concentração de cádmio e manganês nos alimentos é muito baixa e requer uma etapa de preparação da amostra como estratégia de extração (PEREIRA et al. 2020). Metodologias de pré-concentração são usadas para aumentar a concentração do analito a ser analisado, melhorando a sensibilidade de técnicas de detecção analítica, como a espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS), que é robusta, barata e fácil de operar. Por outro lado, o FAAS tem a restrição de ter altos limites de detecção devido à baixa eficiência da nebulização da amostra e ao pouco tempo em que o analito permanece no caminho óptico (KASA et al. 2019). Nesse contexto, procedimentos de microextração empregando solventes orgânicos são amplamente difundidos em metodologias analíticas para extração e pré-concentração de metais. Os sistemas de microextração líquido-líquido dispersivo, microextração de gota única e microextração de fibra oca são os mais amplamente utilizados para esse fim, pois são muito bem-sucedidos na redução da grande quantidade de solventes orgânicos utilizados na extração líquido-líquido convencional (KASA et al. 2019; AN et al. 2017). No entanto, apesar de reduzir o uso de solventes orgânicos, eles ainda estão presentes no sistema e são tóxicos para o meio ambiente e para a saúde humana. Nessas circunstâncias, a técnica dos sistemas aquosos bifásicos (SAB) é uma alternativa eficiente e ambientalmente segura, pois esses sistemas são compostos majoritariamente de água e os outros componentes não são tóxicos ou inflamáveis (GRILO et al. 2016). 59 O SAB é descrito para a extração de íons metálicos desde 1984 e apresenta um alto potencial de separação / purificação / extração desse tipo de analito (ZVAROVA et al. 1984). Desde então, o uso de SAB nas metodologias de separação, pré-concentração e recuperação de íons metálicos tem sido cada vez maior em métodos industriais e analíticos (SHIBUKAWA et al. 2001; RODRIGUES et al. 2012) por se encaixar nos princípios da química verde, ser de baixo custo e alta eficiência de extração (ASSIS et al. 2019; PEREIRA et al. 2020). O SAB pode ser formado pela mistura de duas soluções aquosas de um polímero e de um sal ou outro polímero que, sob certas condições termodinâmicas, resulta na separação espontânea do sistema em duas fases aquosas: a fase superior (FS) é enriquecida com polímero e a fase inferior (FI) é enriquecida com eletrólitos (DA SILVA GONÇALVES et al. 2018). Ambas as fases são compostas principalmente de água e a composição de cada fase é conhecida através de seus diagramas de fases (GAMA et al. 2018). Estudos mostram que os íons metálicos, sem a presença de um extrator, concentram-se preferencialmente na FI do sistema, que é a fase rica em eletrólitos. No ambiente químico da FI, há fortes interações do tipo íon-íon, entre o ânion do sal e os íons metálicos, resultando em complexos com características hidrofílicas que interagem fortemente com os componentes da FI do SAB (DE OLIVEIRA et al. 2017). Vários tipos de combinações entre polímeros e eletrólitos (sais orgânicos e inorgânicos) podem ser usados para formar SAB, dependendo do objetivo de cada aplicação e da natureza do analito (BULGARIU E BULGARIU 2011). Esses sistemas já foram aplicados com sucesso na separação de corantes (BORGES et al. 2016), biomoléculas (SUAREZ RUIZ et al. 2020) e íons metálicos, como: extração de cádmio e níquel (LACERDA et al. 2009); cobre (DE LEMOS et al. 2012); especiação de cromo e arsênio (ASSIS et al. 2019; PATRÍCIO et al. 2016); terras raras (DE OLIVEIRA et al. 2017; DA SILVEIRA LEITE et al. 2020); vanádio e molibdênio (PAN et al. 2020); mercúrio e zinco (HAMTA et al. 2017), entre outros (GRILO et al. 2016). A utilização de SAB´s formados por polietilenoglicol + sais inorgânicos + água aplicados à extração de íons metálicos é muito promissora, uma vez que esse tipo de sistema é de baixo custo e possui estabilidade em soluções ácidas ou básicas. Além disso, a partição de íons metálicos nesses sistemas depende da massa molar e da concentração do polímero, da natureza do eletrólito, do pH do sistema e as características das espécies metálicas de interesse, como grau de hidratação, tamanho e carga (BULGARIU e BULGARIU 2008; GRABER et al. 2000). Assim, é importante escolher uma composição apropriada para o sistema aquoso bifásico, a fim de obter maior rendimento de extração. Uma forma eficiente de otimizar o SAB para extração dos analitos de interesse é utilizando uma metodologia de superfície de resposta (MSR) (MURUCHI et al. 2019; DA SILVEIRA LEITE et al. 2020). A MSR é um conjunto de 60 metodologias estatísticas e matemáticas que mostram a relação entre os parâmetros independentes do experimento e a resposta desejada com o objetivo em encontrar eficientemente, as condições ótimas. Entre as várias metodologias de superfície de resposta, verificou-se que três planejamentos multiníveis comuns, como planejamento de composto central, planejamneto Box–Behnken e planejamento Doehlert são frequentemente utilizados para a otimização final dos processos desejados (NOVAES, et al. 2017). De acordo com uma extensa pesquisa, não há relatos de uso do SAB para pré- concentração de íons metálicos na fase inferior do sistema. Portanto, o objetivo deste estudo é determinar a presença de cádmio e manganês em amostras de alimentos utilizando SAB para extrair e pré-concentrar esses analitos na fase rica em eletrólitos, sem utilizar um agente complexante. Para o desenvolvimento dessa metodologia analítica, fatores que influenciam a extração, como pH, massa molar do polímero e tipo de sal, foram otimizados usando a MSR, enquanto os parâmetros comprimento da linha de amarração (CLA), razão de massa entre as fases e tempos de extração foram avaliados de forma univariada. 61 2. Procedimento Experimental 2.1. Reagentes Os polímeros utilizados para os experimentos foram polietilenoglicol com massa molar média de 1500 (GREENTEC - Brasil), 4000 e 6000 g.mol-1 (Synth - Brasil), denominados, PEG1500, PEG4000 e PEG6000, respectivamente. Os sais utilizados para a formação do SAB foram fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) e sulfato de sódio (Na2SO4), fornecidos pela Dinâmica - Brasil; e sulfato de amônio ((NH4)SO4), citrato de sódio (Na3C6H5O7) e citrato de potássio (K3C6H5O7) fornecido pela Synth - Brazil. Cloreto de cádmio (CdCl2) e cloreto de manganês pentaidratado (MnCl2.5H2O) adquiridos da Isofar - Brasil foram usados para preparo das soluções contendo Cd2+ e Mn2+. Foi utilizado hidróxido de potássio para ajuste do pH das amostras (Proquímicos - Brasil). Ácido nítrico (HNO3 - 65%) e peróxido de hidrogênio (H2O2 - 35%), fornecidos pela NEON - Brasil foram utilizados para digestão das amostras. A água utilizada foi ultrapura (GEHAKA, R ≥ 18 MΩ cm-1). Todos os reagentes eram de qualidade analítica e foram utilizados como recebidos do fabricante, sem purificação adicional. Toda vidraria utilizada foi deixada em banho de ácido nítrico a 10% por 24 horas e em seguida enxaguada com água deionizada. 2.2. Instrumentação A balança analítica (Shimadzu, AUX220) com uma incerteza de 0,0001 g foi utilizada na pesagem e preparação do SAB. O banho ultra-termostático (Marconi, MA184) foi empregado para controlar a temperatura dos experimentos. Todas as amostras tiveram seu pH ajustado pelo medidor de pH (Metrohm 827). O agitador magnético (TECNAL, TE0851) foi utilizado para solubilizar as soluções estoque de polímero e sal. Utilizou-se um forno de microondas com sistema de controle de pressão e temperatura (MARS press, CEM) para digestão das amostras e o espectrômetro de absorção atômica com chama (FAAS) (Varian AA50) para determinar o cádmio e o manganês contidos nas amostras. 2.3. Preparo de soluções estoque Para a obtenção do SAB, soluções estoque de polímero e sal foram preparadas pesando massas definidas de polímero (ou sal) e água para se obter a concentração desejada. 62 Na sequência a mistura foi agitada em agitador magnético até completa solubilização. As soluções dos analitos para os padrões, estudos de otimização e validação foram preparadas utilizando a solução polimérica como solvente. Essas soluções aquosas estoque foram utilizadas nos experimentos de otimização. 2.4. Otimização Multivariada 2.4.1. Planejamento Doehlert Para a otimização do método de extração e pré-concentração de cádmio e manganês foi utilizada a matriz de Doehlert onde avaliou-se a influência das seguintes variáveis: massa molar do polímero (PEG 1500, PEG 4000 e PEG 6000), natureza do sal (K3C6H5O7, K2HPO4, Na3C6H5O7, (NH4)2SO4 e Na2SO4) e pH para se obter as melhores condições experimentais. Para este estudo foram utilizados sistemas com diagramas de fase descritos na literatura e com linhas de amarração próximas entre si como descritos na Tabela 1.1. O desenho apresentou duas variáveis quantitativas (pH e pesos moleculares de PEG) e uma variável qualitativa (sal) designada como X1, X2 e Z, respectivamente. Esses parâmetros foram escolhidos porque geralmente influenciam o desempenho da partição de analitos no SAB (FAKHARI et al. 2017; SHAD et al. 2018). Para os cálculos estatísticos, o nível codificado de cada fator foi calculado pela seguinte equação: 𝑪𝒊 = 𝑿𝒊−𝑿𝒊𝟎∆𝑿𝒊 𝒂 Equação 1.1 onde Ci é o valor codificado para o nível do fator i, Xi seu valor real em um experimento, 𝑋𝑖0 o valor real no centro do domínio experimental, ∆Xi é a variação do valor real e α é o maior valor codificado para cada variável. O número total de experimentos em função do número de fatores estudados (k) é expresso por η = k2 + k + 1, onde k é o número de variáveis. Assim, o delineamento experimental produziu 13 experimentos. Cada um deles foi repetido três vezes para realizar uma análise estatística. Execuções experimentais foram randomizadas para minimizar os efeitos de variabilidade inesperada nas respostas observadas. O pacote estatístico, Statistica versão 6.0, foi utilizado para analisar os dados experimentais. A relação entre a variável de resposta que depende das variáveis independentes para o processo é representada pelo modelo polinomial de segunda ordem na equação 2.1: 63 Y =β0 + β1X1 + β2 X2+ β3 X3 + β11 X12 + β22 X22 + β33 X32 + β12 X1 X2 +β13 X1X3 + β23 X2 X3 Equação 2.1 onde Y é a resposta, β0 é o termo constante; β1, β2 e β3 são o coeficiente de termos lineares; β11, β22 e β33 são o coeficiente de termos quadráticos; β12, β13 e β23 são o coeficiente de termos de interação, respectivamente. O procedimento foi realizado misturando-se 8,00 g de solução de polímero com o analito e 2,00 g de solução de sal em um tubo, na sequência foram agitados manualmente e deixados em repouso em banho ultra-termostatizado por 24 horas a 298,15 K. Decorrido este tempo a fase inferior é retirada, diluída duas vezes com água e levada para medir o sinal analítico no FAAS. Para cada ponto avaliado foi realizado um ensaio em branco. Tabela 1.1 - Composição do SAB estudada com concentração expressa em porcentagem (massa/massa). ATPS Fase Superior Fase Inferior CLA Ref. PEG Sal Água PEG Salt Água PEG4000 + K3C6H5O7 34,8 5,20 60,0 0,200 25,8 74,0 40,3 (Wysoczanska et al. 2016) PEG4000 + K2HPO4 35,8 2,18 61,9 1,16 22,2 76,6 40,0 (Carvalho et al. 2007) PEG1500 + Na3C6H5O7 35,1 4,30 60,6 0,500 27,1 72,4 41,4 (Silvério et al. 2012) PEG1500 + (NH4)2SO4 37,2 3,06 59,7 3,04 26,1 70,8 41,2 (De Lemos et al 2011) PEG4000+ Na2SO4 36,5 2,34 57,4 0,100 19,9 79,3 40,5 (Barbosa et al. 2016) PEG6000 + Na3C6H5O7 36,2 2,43 61,3 0,230 18,4 81,4 39,3 (Ghaffari et al. 2019) PEG6000 + (NH4)2SO4 39,2 2,90 57,9 1,50 19,5 79,0 41,2 (Salabat 2001) 2.5. Otimização Univariada 2.5.1. Escolha do melhor CLA Os CLAs 32,6; 44,6 e 53,3 %m/m foram avaliadas em diversas razões mássicas entre as fases, sendo que o intuito foi verificar a pré-concentração na fase inferior e em que linha de 64 amarração iria se obter a maior extração. O estudo foi feito apenas com cádmio na concentração de 50,0 µg kg-1, pois em um SAB os íons metálicos apresentam comportamento de partição semelhantes. Massas da solução estoque de polímero contendo o metal, da solução estoque de sal e água foram pesadas, de acordo com as concentrações expressas na Tabela 1.1. Em seguida, os tubos foram agitados manualmente e deixados em um banho ultra-termostático por 24 horas a 298,15K. Após esse período, uma alíquota da fase inferior de cada sistema foi removida e diluída duas vezes e a absorbância foi medida com FAAS. A porcentagem de extração foi usada como parâmetro para escolha do melhor CLA que é calculada de acordo com a equação 3.1. % 𝑬 = 𝒏𝑴𝑭𝑰𝒏𝑴𝒕 × 𝟏𝟎𝟎 Equação 3.1 Onde 𝑛𝑀𝐹𝐼 é o número de mols de metal na fase inferior e 𝑛𝑀𝑡 é o número de mols de metal total que foi adicionado ao sistema. Para que fosse possível calcular a porcentagem de extração com a maior confiabilidade foram preparados sistemas aquosos em provetas de 10,0 mL para cada razão mássica testada, para medir o volume de cada fase. Também foi determinada a densidade da fase inferior para que este volume pudesse ser convertido em massa e posteriormente os dados foram usados para se obter os números de mols necessários para equação 1.9 descrita no referencial teórico. A figura 1.1 mostra alguns dos sistemas obtidos durante o experimento. Figura 1.1 – Fotografia do SAB preparado em diferentes proporções de razão mássica. Fonte: próprio autor 65 2.5.2. Melhor tempo de extração Para se determinar o melhor tempo de extração foram utilizados os parâmetros ótimos definidos na matriz Doehlert. Assim, adicionou-se 11,1 g de solução de PEG4000 49,0 %m/m, 0,502g de solução de fosfato de potássio dibásico 31,0 %m/m e 0,369 g de água deionizada em um tubo falcon de 15,0 mL. O tubo foi agitado manualmente e levado para o banho ultra- termostatizado por 2, 4, 6, 8, 12, 18 e 24 horas para avaliar qual o tempo mínimo necessário para se obter a máxima %E possível. Em seguida, foi retirada a fase inferior e diluída duas vezes com água e levada para detecção no FAAS. 2.5.3. Extração de íons metálicos em ensaios com SAB Todos os SAB´s estudados neste capítulo estão descritos na literatura, como mostra a Tabela 1.1. Após a definição do melhor sistema, CLA, razão mássica e tempo foi definido um procedimento ideal para extração dos analitos de interesse, como ilustrado na figura 1.1. Figura 1.1 - Esquema do procedimento de extração e pré-concentração na fase inferior usando SAB Fonte: próprio autor Foram adicionados a um tubo falcon soluções estoque de polímero (11,1g a 49,0% m/m) e sal (0,502g a 31,0%) e 0,369g de água. Em seguida o tubo foi agitado manualmente até a completa mistura dos componentes e depois levado para banho ultra-termostatizado à 298,15 K por 18 horas. Decorrido este período há a formação de um pequeno volume de fase inferior 66 no fundo do tubo, a qual é então retirada com o auxílio de uma seringa e diluído com água. Logo após é realizada a medida com FAAS e posteriormente o tratamento dos dados. Para cada leitura foi preparada uma curva analítica e um branco nas mesmas condições. O estudo foi conduzido nas concentrações de 10,0 µg kg-1 para cádmio e 50,0 µg kg-1 para manganês. 2.5.4. Interferentes A influência de íons interferentes nos estudos de extração de Mn (II) e Cd (II) foi realizado com soluções de cádmio de 10,0 µg kg-1 e soluções de manganês de 50,0 µg kg-1, preparadas com a adição de quantidades conhecidas dos seguintes íons interferentes: Na (I), Cu (II), Mg (II), Ni (II), SO42-, NO3-, CO32-, Pb (II), Fe (III), Ca (II), Li (I), Al (III), Co (II), Mn (II), Zn (II), Cr (III), Cr (VI), Fe (II) e Cd (II); os quais foram submetidos ao procedimento de extração. Foi considerado como interferência a concentração do concomitante que gerou uma variação maior que 5% na concentração do analito obtida em relação ao sistema sem a presença do íon interferente. 2.6. Preparo de amostras reais e material certificado Amostras de café solúvel e chá verde industrializadas foram adquiridas no comércio local. O processo de digestão consistiu em pesar 0,200 g de amostra em um tubo de Teflon e, em seguida, foram adicionados 4,00 mL de ácido nítrico 3,00 mol.L-1 e 1,00 mL de H2O2 a 30%. Em seguida, os tubos foram levados ao forno de microondas com a seguinte programação: potência de 1600W por 3 minutos a 100 ° C; 1600W por 2 minutos a 160 ° C; 1600W por 10 minutos a 200 ° C e 15 minutos de resfriamento. Após a digestão, o pH das amostras foi ajustado para 6,50 com KOH 5,00 mol.L-1 e o volume final foi ajustado para 10,0 mL com água deionizada. Este digerido da amostra foi usado para preparar as soluções de polímero e sal para a preparação do SAB conforme condições ótimas obtidas previamente. O Material de Referência Certificado NIST 1575a foi submetido ao mesmo processo de digestão mencionado acima, e apenas para a amostra certificada NIST 1515 a massa pesada foi de 0,500 g. Amostras de digestão em branco também foram rotineiramente preparadas e realizadas da mesma maneira durante todo o procedimento analítico com cada lote da digestão. 67 2.7. Características Analíticas Para estudar a linearidade, uma curva de calibração pré-concentrada foi construída na faixa de concentração de 1,50-25,0 μg kg-1 para o cádmio e 21,0-150 µg kg-1 para o manganês. As soluções em branco foram preparadas em dez repetições independentes para determinar o limite de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ). O LD foi calculado como a razão de 3 vezes o desvio padrão do branco pela inclinação da curva analítica pré-concentrada e o LQ é dado pela razão de 10 vezes o desvio padrão do branco pela inclinação da curva analítica pré- concentrada. Oito réplicas foram preparadas na concentração de 10 µg kg-1 de cádmio e de 50 µg kg-1 de manganês para ensaios de precisão intra e inter-dia. O fator de enriquecimento foi calculado pela razão entre a inclinação da curva pré-concentrada e a curva direta. Para a análise de exatidão, foram utilizados estudos de recuperação e análise de amostras certificadas de folha de maçã NIST 1515 para manganês e folha de pinheiro NIST 1575a para cádmio. O método otimizado foi aplicado a amostras de chá verde e café solúvel para determinação de cádmio e manganês. 68 3. Resultados e Discussão Geralmente, íons metálicos adicionados a um sistema aquoso bifásico formado por polímero/sal/água são concentrados preferencialmente na fase inferior, rica em eletrólitos, devido às interações entre o cátion metálico e o ânion do sal usado na formação do SAB. Assim, é possível concentrar íons metálicos na FI do sistema sem adicionar um agente extrator. Um planejamento experimental utilizando uma matriz Doehlert foi aplicado para definição da melhor composição do SAB para extração de cádmio e manganês. Posteriormente, foi realiza a otimização do CLA, razão mássica e tempo de extração para a pré-concentração de Cd e Mn, além da avaliação da presença de íons interferentes. Após a otimização de todas as variáveis a metodologia proposta foi submetida a validação analítica, onde todos os parâmetros foram determinados, e, em seguida, foi realizada a aplicação em amostras de chá e café solúvel. 3.1. Design Experimental A matriz de Doehlert foi utilizada para otimizar três variáveis independentes: pH, sal e MM do PEG. O pH foi estudado no intuito de estabelecer se sua variação causaria ou não interferência na extração do íon metálico e a avaliação da MM do PEG e o sal, entre os sistemas escolhidos, foi realizada para definir qual a melhor composição do SAB para que houvesse a maior extração sem adição de um agente extrator. As variáveis nos valores codificados e não codificados, juntamente com a resposta nos valores de absorbância para a eficiência de extração, são mostradas na Tabela 1.2. De acordo com a matriz de Doehlert, foram realizados experimentos com diferentes combinações das variáveis independentes, a fim de avaliar os efeitos combinados desses fatores na resposta. 69 Tabela 1.2 - Matriz Doehlert para três variáveis independentes com valores e resposta codificados e não codificados. N° de experimentos Valores codificados Valores reais Resposta (absorvância) X1 Z X2 pH Ânion (sal) PEG MM 1 1,00 0,00 0,00 8,50 K2HPO4 4000 0,270 2 0,500 -1,00 -0,707 7,50 (NH4)2SO4 1500 0,311 3 0,500 -1,00 0,707 7,50 (NH4)2SO4 6000 0,297 4 0,500 1,00 -0,707 7,50 Na3C6H5O7 1500 0,167 5 0,500 1,00 0,707 7,50 Na3C6H5O7 6000 0,140 6 0,00 -0,50 0,00 6,50 Na2SO4 4000 0,210 7 0,00 0,00 0,00 6,50 K2HPO4 4000 0,254 8 0,00 0,500 0,00 6,50 K3C6H5O7 4000 0,195 9 - 0,50 -1,00 -0,707 5,50 (NH4)2SO4 1500 0,303 10 - 0,50 -1,00 0,707 5,50 (NH4)2SO4 6000 0,300 11 - 0,50 1,00 -0,707 5,50 Na3C6H5O7 1500 0,171 12 - 0,50 1,00 0,707 5,50 Na3C6H5O7 6000 0,160 13 -1,00 0,00 0 4,50 K2HPO4 4000 0,258 O modelo quadrático de segunda ordem expresso pela equação 4 representa a Resposta Analítica (RA) em função do pH, sal (SA) e PEG MM (MM) para modelagem dos dados experimentais: 70 RA = 0,251 + 0,00071 (pH) - 0,068 (SA) - 0,0097 (MW) +0,13 (pH)2 - 0,19 (SA)2 + 0,34 (MM)2 - 0,0076 (pH) (SA) - 0,0098 (pH) (MM) - 0,0038 (SA) (MM) Equação 4.1 A derivatização parcial desta equação geral em relação às variáveis (pH), (SA) e (MM) resulta em três novas equações (eq. 5, 6 e 7): d (RA) / d (pH) = 0,00071 + 0,026 (pH) - 0,0076 (SA) - 0,0098 (MM) = 0 Equação 5.1 d (RA) / d (SA) = - 0,068 - 0,0076 (pH) - 0,38 (SA) - 0,0038 (MM) = 0 Equação 6.1 d (RA) / d (MM) = - 0,0097 - 0,0098 (pH) + 0,0038 (SA) - 0,68 (MM) = 0 Equação 7.1 Os valores críticos para as variáveis são encontrados através da resolução desse sistema de equações para a seguinte condição: d (RA) / d (pH) = 0; d (AR) / d (SA) = 0; e d (RA) / d (MM) = 0 Os dados foram tratados e geraram as superfícies de resposta apresentadas na figura 3. Analisando a curva de nível é possível fazer as seguintes observações: Na SR I e II verifica-se que variável resposta não se altera à medida que o pH varia, inferindo que este não interfere significativamente na resposta. Assim, no intervalo do domínio experimental estudado entre os valores de pH de 4,50 até 8,50 a resposta não se altera significativamente. Para o ânion do sal e massa molar do polímero na SR III é possível observar que ambos tendem para o ponto central, ficando claro que o nível 0 é a melhor opção. Assim, o sal fosfato de potássio e PEG4000 são os componentes formadores do melhor sistema. Em resumo, as condições experimentais ideais para o procedimento SAB foram estabelecidas em: pH = 6,50, SA = K2HPO4 e PEG MM = 4000. 71 Figura 1.3 - Superfícies de resposta para o planejamento Doehlert: Análise de pH e ânion do sal (I), pH e massa molar do polímero (II) e ânion do sal e massa molar do polímero (III). 72 Os sistemas aquosos bifásicos formados por sal e polímero compreendem uma mistura complexa onde estão presentes íons, moléculas de água e cadeias de polímeros, sendo que cada componente interage efetivamente com os demais componentes. Assim, é necessário que se considere os efeitos cruzados e a interações do tipo íon-água, íon-polímero, íon-íon, polímero- água, polímero-polímero e interações água-água que ocorrem entre todos os componentes presentes no sistema (MOGHADDAM et al. 2019). Cada uma dessas interações pode contribuir para que um determinado sistema seja mais efetivo na extração do íon metálico. Outro fator que deve ser considerado é o fato de que, na ausência de um agente extrator, o metal forma um complexo com o ânion do sal através de uma forte interação do tipo íon-íon, entre o ânion do sal (HPO4-) e os íons Cd2+ se concentrando assim na fase inferior do sistema. Além disso, estes íons metálicos possuem alta tendência de hidratação, particionando-se preferencialmente para a fase com mais água (FI). A análise de variância (ANOVA) para o modelo quadrático da superfície de resposta é fornecida na Tabela 1.3. A significância dos termos do modelo é verificada por seus respectivos valores de p. Um valor de p menor que 0,05 sugere que os termos do modelo são significativos. Tabela 1.3 - Análise de variância (ANOVA) para o modelo quadrático ajustado. SQ gl MQ F p pH 0.000002 1 0.000002 0.0386 0.862406 AS 0.039576 1 0.039576 761.0860 0.001311 MM 0.000378 1 0.000378 7.2716 0.114399 pH2 0.000203 1 0.000203 3.9000 0.186971 SA2 0.002803 1 0.002803 53.9103 0.018049 MM2 0.002486 1 0.002486 47.8051 0.020284 pH - SA 0.000115 1 0.000115 2.2118 0.275332 pH - MM 0.000096 1 0.000096 1.8400 0.307780 SA - MM 0.000059 1 0.000059 1.1285 0.399408 Falta de Ajuste 0.001602 3 0.000534 10.2686 0.090039 Erro Puro 0.000104 2 0.000052 SQ= soma quadrática; gl= grau de liberdade; MQ= média quadrática. 73 A qualidade do ajuste do modelo foi verificada pela determinação do coeficiente (R2) e adj R2. O alto valor de R2 (0,9634) indica uma boa correlação entre os valores experimentais e previstos, e a variabilidade de 96,3% da resposta pode ser explicada pelo modelo. O valor de Adj R2 varia de 0 a 1,0 e o valor de R2 próximo a 1,0 implica em melhor precisão do modelo. O valor de Adj R2 (0,8974) foi considerado muito próximo de R2. O teste de falta de ajuste mede a falha do modelo em representar dados experimentais no domínio experimental, em um ponto não incluído na análise de regressão (SHARMA et al. 2009). A falta de ajuste foi considerada não significativa (valor de p = 0,09), indicando que a equação do modelo foi adequada para prever a resposta sob conjuntos distintos de combinação das variáveis. Os valores da porcentagem de extração observados foram plotados em função dos valores previstos pelo modelo (Fig. 1.4) e sugerem uma correlação satisfatória entre o valor experimental e o previsto (R2), onde os pontos são centralizados adjacentes à linha diagonal. Figura 1.4- Gráfico de paridade do modelo de eficiência observado. 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0,30 0,32 0,34 Observed Values 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0,30 0,32 0,34 P re d ic te d V a lu e s Portanto, o sistema aquoso bifásico formado por PEG 4000, fosfato de potássio dibásico e água gera a maior extração do íon metálico para a fase inferior. 3.2. Estudo da razão mássica e melhor CLA O CLA é um parâmetro termodinâmico, geralmente considerado como variável determinante nos processos de partição dos solutos em SAB´s e utilizado para medir a diferença das propriedades intensivas entre as fases em equilíbrio, determinadas pela composição de cada 74 fase. O comprimento da linha de amarração é calculado pela Equação 1.3. Quando se trata de aplicações em metodologias analíticas é possível obter através do CLA os pontos com a mesma diferença entre as propriedades das fases e ao mesmo tempo modular a razão entre os volumes das fases, sendo possível concentrar o analito no menor volume de fases possível (GRILO, 2016). Os CLAs foram avaliados para verificar em qual deles haveria maior migração do metal para a fase rica em eletrólitos, já a razão mássica foi avaliada para definir o limite de formação de um sistema bifásico com uma menor razão mássica entre as FI e FS possível, possibilitando a maximização da pré-concentração no sistema. O estudo foi realizado apenas para cádmio, uma vez que manganês apresenta o mesmo comportamento do SAB estudado. Figura 1.2 - Comportamento de extração do Cd (II) em função da razão de massa entre as fases nos seguintes valores de CLA. CLA = 32,6 (- ■ -), CLA = 44,6 (- ● -) e CLA = 53,3 %m/m (- ▲ -). SAB: PEG 4000 + K2HPO4 + H2O à 298,15K. Pode ser verificado na Figura 1.5 que a porcentagem de extração está acima de 94,0% para todas as razões de massa e valores de CLA, indicando que a ambas variáveis têm pouco efeito no comportamento de extração do íon metálico. Como o CLA mede a diferença de composição entre as fases superior e inferior, expressando as distinções entre as propriedades termodinâmicas intensivas. Quanto mais altos os valores de CLA, mais distintas são as fases do SAB, apresentando maiores diferenças em suas composições, o que pode melhorar o particionamento dos solutos no SAB. No entanto, neste estudo, os resultados mostraram que o 75 menor CLA estudado já é suficiente para atingir a extração máxima, já que a quantidade de analito no SAB é muito menor do que a concentração dos componentes formadores das fases. O maior CLA (53,3% m/m) foi escolhida devido à maior concentração de componentes formadores do SAB, tornando o sistema mais robusto e ao mesmo tempo mais adequado para aplicação em amostras complexas. A razão de massa selecionada foi de 0,029, que apresentou a menor massa de fase inferior e consequentemente a maior a fase superior, permitindo a obtenção de um maior fator de pré-concentração. Os íons metálicos estão concentrados na FI, que é mais enriquecida em eletrólitos e água do que a fase superior. Nesse ambiente químico, há fortes interações do tipo íon-íon entre íons cádmio (ou manganês) e ânions monofosfato (eq. 8.1 e 9.1), que são as espécies predominantes de fosfato em solução neste valor de pH, e interações tipo íon-dipolo entre as moléculas de água e íons metálicos (eq. 10.1 e 11.1). Cd (II) (∆𝑮hid = - 𝟏𝟕𝟓𝟓 𝑲𝑱𝒎𝒐𝒍- 𝟏) e Mn (II) (∆𝑮hid = - 𝟏𝟕𝟔𝟎 𝑲𝑱𝒎𝒐𝒍- 𝟏) estão concentrados na fase com o maior teor de água (FI), devido as suas altas tendências de hidratação (Marcus, 1991), sendo que esses complexos têm características hidrofílicas, que interagem fortemente com os componentes da FI do SAB (De Souza et al. 2018). 𝑪𝒅(𝒂𝒒)𝟐+ + 𝒙𝑯𝟐𝑷𝑶𝟒(𝒂𝒒)− ⇋ 𝑪𝒅(𝑯𝟐𝑷𝑶𝟒)𝒙(𝒂𝒒)(𝒙−𝟐)− Equação 8.1 𝑴𝒏(𝒂𝒒)𝟐+ + 𝒙𝑯𝟐𝑷𝑶𝟒(𝒂𝒒)− ⇋ 𝑴𝒏(𝑯𝟐𝑷𝑶𝟒)𝒙(𝒂𝒒)(𝒙−𝟐)− Equação 9.1 𝑪𝒅(𝒂𝒒)𝟐+ + 𝒙𝑯𝟐𝑶 ⇋ 𝑪𝒅(𝑯𝟐𝑶)𝒙(𝒂𝒒)𝟐+ Equação 10.1 𝑴𝒏(𝒂𝒒)𝒏+ + 𝒙𝑯𝟐𝑶 ⇋ 𝑴𝒏(𝑯𝟐𝑶)𝒙(𝒂𝒒)𝟐+ Equação 11.1 A figura 1.6 mostra a pré-concentração do analito na fase inferior de um SAB, onde os reagentes e analitos são adicionados em um tubo e após agitação e repouso há separação de fases, onde uma das fases tem volume bem superior à outra e o analito se concentra na fase rica em eletrólito. As condições experimentais otimizadas irão favorecer a afinidade do analito com a fase de menor volume para que a pré-concentração seja possível. 76 Figura 1.6 – Sistema aquoso formado por PEG400 + K2HPO4 + H2O para pré-concentração de Cd (II) e Mn (II) Fonte: Próprio autor 3.3. Tempo de Extração O tempo de extração foi avaliado durante o período em que o sistema foi mantido em banho ultra-termostático à 298,15 K. Como mostrado na Figura 1.7, a maior porcentagem de extração foi obtida em 18 horas, sendo este o tempo escolhido para os estudos posteriores. Esta configuração de SAB utilizada neste trabalho possui uma grande quantidade de solução polimérica e uma pequena quantidade de solução salina, o que permitiu observar durante os experimentos, que em menos de 18 horas o sistema ainda não havia atingido totalmente o equilíbrio (sistema turvo), resultando em uma baixa porcentagem de extração. Assim como o estudo de CLA e razão mássica, este foi realizado apenas para cádmio. 77 Figura 1.7 - Efeito do tempo de extração no comportamento de extração de Cd (II). SAB: PEG400 + K2HPO4 + H2O à 298,15K. 3.4. Estudo de Interferentes O estudo de íons que podem interferir na pré-concentração é bastante citado na literatura visando avaliar a seletividade da metodologia proposta. A Tabela 1.4 mostra a concentração máxima de interferente que não afeta a determinação da concentração do analito na amostra analisada, sendo que nas concentrações mínimas testadas não houve interferência. Foi considerada como interferência uma variação de 5% no sinal analítico obtido comparada ao procedimento de extração de cádmio e manganês sem o interferente. 78 Tabela 1.4 - Efeito de íons interferentes na extração de cádmio e manganês. Interferente Manganês (mol/mol) Cádmio (mol/mol) Recuperação (%) Na+ 100 50,0 93,0-95,0 Cu2+ 10000 100 94,0-98,0 Mg2+ 100 100 97,0-100 Ni2+ 10000 100 96,0-99,0 SO42- 1000 100 100 NO3- 1000 100 99,0-100 CO32- 1000 100 96,0-98,0 Pb2+ 1000 100 97,0-99,0 Fe3+ Ca2+ 100 100 100 500 94,0-96,0 96,0 Li+ 10000 1000 101-103 Al3+ 1000 1000 98,0-101 Co2+ 10000 1000 94,0-97,0 Mn2+ - 1000 99,0 Zn2+ 10000 1000 100 Cr3+ Cr6+ 1000 10000 10000 5000 100 98,0-100 Fe2+ 10000 5000 95,0-96,0 Cd2+ 10000 - 100 As quantidades de íons interferentes apresentadas acima são relativamente elevadas se comparadas às quantidades encontradas em muitas amostras de chá verde e café solúvel, mostrando que o método é seletivo para os analitos de interesse. 79 3.5. Características Analíticas Após a otimização de todos os parâmetros para a metodologia proposta, a validação foi realizada por meio da análise de figuras de mérito, conforme apresentado na Tabela 1.5. O método apresenta boa precisão, avaliada através da medição de oito repetições intra- e inter- dias, na concentração de 10,0 µg kg-1 de cádmio e 50,0 µg kg-1 de manganês, sendo que os valores obtidos variaram entre 3,28-6,60%. Foram alcançados limite de detecção de 0,450 e 6,40 µg kg-1, enquanto que os limites de quantificação foram de 1,50 e 21,0 µg kg-1 para cádmio e manganês, respectivamente. Tabela 1.5 - Características analíticas do sistema PEG 4000 + K2HPO4 + H2O para pré- concentração de cádmio e manganês. Parâmetros Analíticos Cádmio Manganês Faixa de trabalho (µg kg-1) LD (µg kg-1) 1,50 – 100 0,450 21,0 – 150 6,40 LQ (µg kg-1) 1,50 21,0 RSD(%) intra e inter-dia (n=8) 3,28 – 4,37 5,05 – 6,60 Equação da curva analítica com pré-concentração 0,00189 + 0,0676x -0,0158 + 0,0357x Coeficiente de correlação (R2) 0,999 0,998 Equação da curva analítca sem pré-concentração -0,00238 + 0,0410x - 2,85 x 10-4 + 7,94 x 10-4x Coeficiente de correlação (R2) 0,999 0,999 Fator de enriquecimento 16,6 45,5 O estudo da linearidade foi realizado utilizando uma curva de calibração obtida com a pré-concentração doa padrões do analito e as faixas lineares obtidas são adequadas para a determinação desses analitos em amostras de alimentos. As curvas de calibração com e sem pré-concentração para cádmio e manganês são mostradas nas Figuras 1.8 e 1.9. As equações 80 geradas por estas curvas foram usadas para calcular o fator de enriquecimento (FE), que atingiram 16,6 para Cd e 45,5 para Mn, que estão em um nível semelhante ou superior quando comparados a outros estudos publicados que utilizam pré-concentração e detecção pelo FAAS. Figura 1.3 - Curva de calibração com (●) e sem pré-concentração (■) para cádmio Figura 1.4 - Curva de calibração com (●) e sem preconcetração (■) para manganês As metodologias de pré-concentração de manganês com sistema automatizado on-line com base no uso de dois reatores e um sistema de extração de pontos de nuvem on-line alcançaram valores de FE de 8 (BARRETO et al. 2020) e 17 (LEMOS e DAVID, 2010), sendo que neste trabalho obtido um EF (45,5) maior que os trabalhos citados. Para o cádmio, a extração do ponto de nuvem com detecção FAAS e microextração com líquido iônico e a determinação por espectrometria de atomização eletrotérmica alcançaram valores de EF de 13,5 81 (XIANG et al. 2012) e 24,0 (SANTOS et al. 2019), sendo semelhantes ao valor encontrados neste trabalho que foi de 16,6. A exatidão da metodologia desenvolvida foi avaliada aplicando o sistema em material de referência certificado, conforme mostrado na Tabela 1.6. Tabela 1.6 - Determinação de cádmio no material de referência certificado NIST 1575a e manganês no NIST 1515. Material certificado Quantidade de cádmio (mg kg-1) % Recuperação Valor certificado Valor encontrado NIST 1575ª 0,233 ± 0,004 0,227 ± 0,017 98,2 ± 2,98 Quantidade de manganês (µg kg-1) NIST 1515 Valor certificado 54,1 ± 1,1 Valor encontrado 53,6 ± 2,39 99,2 ± 4,42 ________________________________________________________________________ Os resultados mostram que a metodologia proposta alcançou 98,2% de recuperação para amostra certificada de agulha de pinheiro (NIST 1575a) para determinação de cádmio, já a amostra certificada de folha de maçã (NIST 1515) foi utilizada para determinação de manganês e apresentou recuperação de 99,2%. Esses resultados mostram a alta exatidão da metodologia desenvolvida e a ausência de diferenças significativas entre os resultados e os valores certificados dos materiais de referência após comparação estatística usando um teste t (intervalo de confiança 95%, n = 3). 3.6. Aplicação em amostras Reais A ANVISA estabelece que a dose de ingestão diária de manganês recomendada para um adulto deve ser 2,30 mg e o limite máximo de cádmio tolerado em amostra de chá e café solúvel é de 0,400 mg kg-1 e 0,200 mg kg-1, respectivamente. De acordo com os resultados apresentados na tabela 1.7 para as amostras de chá verde e café solúvel analisadas estão dentro dos padrões recomendados. 82 Tabela 1.7 - Determinação de cádmio e manganês em amostras de café solúvel e chá verde. O cádmio não foi detectado, indicando que a concentração nessas amostras estava abaixo do valor do LD do método. Com a adição de 5,00 e 15,0 µg kg-1 deste analito às amostras, os valores de recuperação obtidos variaram entre 94,2 e 98,6%. O manganês foi determinado nas amostras de café pelo método desenvolvido, obtendo-se 252 ± 1 µg kg-1. No café solúvel, a metodologia de pré-concentração proposta foi aplicada para determinar o manganês, atingindo uma porcentagem de recuperação entre 100 e 110%. A aplicação do teste t mostrou que não houve diferenças significativas entre os valores adicionados e os valores encontrados, considerando o intervalo de confiança de 95,0%, com n = 3. Esses resultados mostram a aplicabilidade deste método baseado em SAB para a determinação de cádmio e manganês em concentrações vestigiais com alta precisão e exatidão em amostras de alimentos. Amostra Cádmio Manganês Adicionado (µg kg-1) Encontrado (µg kg-1) Recuperado (%) Adicionado (µg kg-1) Encontrado (µg kg-1) Recuperação (%) Chá verde - ND - - - 5,00 4,71 ± 0,140 94,2 ± 2,79 - - - 15,0 14,3 ± 0,150 95,6 ± 1,07 - - - Café solúvel - 5,00 ND 4,70 ± 0,08 - 94,0 ± 1,57 - 50 252 ± 1,43 332 ± 1,05 - 110 ± 2,50 15,0 14,8 ± 0,450 98,6 ± 1,54 150 402 ± 0,620 100 ± 1,83 83 4. Conclusão Um novo método de extração e pré-concentração de cádmio e manganês em amostras de alimentos utilizando um sistema aquoso bifásicos sem complexante é apresentada como uma alternativa àqueles que utilizam solventes orgânicos. Pela primeira vez, sistemas aquosos bifásicos foram utilizados para pré-concentração de íons metálicos na fase inferior para fins analíticos. O método consiste na pré-concentração dos analitos em uma fase rica em sal e subsequente detecção empregando FAAS. Parâmetros otimizados mostraram que os valores de pH e comprimento da linha de amarração não influenciam a extração nos intervalos estudados, enquanto o tempo de extração e a composição do SAB têm fortes efeitos na partição dos íons metálicos. Assim, o sistema com melhor desempenho foi PEG4000 + K2HPO4 + H2O com tempo de extração de 18 hs, CLA = 53,3 %m/m e razão de massa de 0,0290. A validação do método mostrou alta exatidão e precisão, e o LD, LQ e o fator de enriquecimento são suficientes para determinar os dois analitos em amostras de alimentos. Portanto, a metodologia proposta é eficiente na pré-concentração de cádmio e manganês nas amostras de café solúvel e chá verde analisadas, sem a necessidade de uso de um extrator, sendo uma alternativa altamente exata e ambientalmente segura para a determinação de níveis traço de metal nas amostras de alimentos. A metodologia desenvolvida permite melhorar a sensibilidade do FAAS, que é uma técnica de baixo custo, alta exatidão e precisão. 84 5. Referências Bibliográficas ANVISA, RDC nº 42 de 29 de agosto de 2013 – Regulamento técnico Mercosul sobre limites máximos de contaminantes inorgânicos em alimentos. ANVISA, Resolução de diretoria colegiada – rdc nº 269, de 22 de setembro de 2005 ASSIS, Roberta C. et al. Extraction of arsenic (III) in aqueous two-phase systems: A new methodology for determination and speciation analysis of inorganic arsenic. Microchemical Journal, v. 147, p. 429- 436, 2019. BARRETO, Jeferson A. et al. 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Uma otimização multivariada com um planejamento fatorial fracionário foi aplicada, para definição de quais variáveis são significativas no sistema e depois uma matriz Box-Behnken foi usada para encontrar os pontos críticos para estas variáveis, onde ficou definido que o pH ideal é 3,60, o tempo de centrifugação de 2 minutos a 4000 rpm, tempo de banho ultra- termostatizado de 2,12 horas e concentração de complexante Br-PADAP de 0,00810 % m/m. Em condições de extração otimizadas o método apresentou LD e LQ de 0,0220 μg kg-1 e de 0,665 μg kg-1, respectivamente; precisão de 2,51% e fator de enriquecimento de 19,1. A metodologia foi aplicada em amostras de referência certificada de folhas de maçã (NIST 1515) com recuperação de 94,1% e em amostras de alimentos com valores de porcentagem de recuperação de 93,8-108%. Portanto, uma nova metodologia eficiente e livre de solventes orgânicos foi desenvolvida para determinação de vanádio em amostras de alimentos. Palavras-chave: sistema aquoso bifásico; pré-concentração; vanádio; amostras de alimentos 89 1. Introdução A exposição ao vanádio pode causar danos à saúde, e a extensão destes danos está ligada a quantidade e ao seu estado de oxidação, já que ele existe em nox que variam de +1 a +5. Em meio aquoso há predominância de V(IV) e V(V), pois as condições como pH, potencial redox e força iônica permitem a coexistência dessas espécies que possuem propriedades nutricionais e tóxicas diferentes, sendo o V(V) considerado mais tóxico que o V(IV) (ŚCIBIOR et al. 2020; ZONUR et al. 2018; TAFTI et al. 2018). Como o vanádio possui papel essencial e tóxico, é grande o interesse sobre seu comportamento em campos como a biologia, química e meio ambiente, pois quando presente em níveis baixos (<10 μg kg-1 para animais e <10μg dia para humanos), possui características semelhantes a insulina diminuindo níveis de glicose na corrente sanguínea de pacientes diabéticos, porém em níveis mais elevados, ( > 3mg/dia em humanos) é extremamente tóxico podendo causar problemas como anemia e aumento de chances de desenvolvimento de câncer de pulmão ( EVANGELOU 2002; ANKE, 2004) . A presença de vanádio na crosta terrestre é baixa e suas fontes naturais são vulcões, incêndios florestais, sal marinho, entre outros. É liberado no meio ambiente, principalmente, através de fontes antropogênicas como a queima de combustíveis fósseis e por indústrias metalúrgicas, fábricas de produtos químicos, refinarias de petróleo e carvão. No ambiente também está presente o V2O5 que é derivado da queima de combustíveis líquidos e sólidos e também de resíduos urbanos resultando em um aumento do risco de exposição (EVANGELOU 2002; MACHÁČKOVÁ et al. 2009; ŚCIBIOR et al. 2020). A existência de vanádio nas plantas é resultado das diversas fontes citadas acima, além da presença nas águas residuais da indústria, elevando seu nível no solo e nos lençóis freáticos e com isso aumenta a absorção deste metal pelas plantas, desta forma, este elemento entra no organismo animal e humano através da alimentação (ŚCIBIOR et al. 2020). O vanádio é encontrado em quantidades traço em diversos alimentos, sendo que a quantidade presente está diretamente relacionada a sua presença e concentração no solo. Quando consumido é armazenado no tecido adiposo e quantidades traço podem se depositar nos ossos, fígado, rim e baço (ZONUR et al. 2018). Para que seja possível determinar vanádio em alimentos é necessária uma etapa de pré-tratamento, já que este metal se encontra em concentração muito pequena neste tipo de amostra. Por isso, etapas de pré-concentração do analito são muito utilizadas para determinação de vanádio por 90 técnicas espectrométricas como espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS), espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (GFAAS), espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES), espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) (FILIK et al. 2008) e espectrofotometria de absorção molecular (UV-Vis) (USLU et al. 2013; SANTOS E LEMOS, 2015), aumentando assim a sensibilidade. Trabalhos relatados na literatura usando técnicas de pré-concentração conseguiram bons resultados na determinação de vanádio em amostras de alimentos como leite, frutas, verduras, cogumelos e frutos do mar (WADHWA et al. 2013; SANTOS E LEMOS, 2015; KAZI et al. 2015). Dentre as metodologias de pré-tratamento de amostras para determinação de vanádio podemos citar a extração em ponto nuvem (FILIK et al. 2018; GURKAN, et al. 2016), microextração líquido-líquido (ASADOLLAHI et al. 2010, USLU et al. 2013) e microextração em fase sólida (Pyrzyńska et al. 2004; MACHÁČKOVÁ et al. 2009). Uma alternativa promissora de pré-tratamento de amostras são os sistemas aquosos bifásicos (SAB), pois são eficientes, possuem baixa tensão interfacial, baixo custo e não utilizam solventes orgânicos nem outros componentes tóxicos, sendo assim apresenta-se como uma técnica ambientalmente segura (DA SILVA et al. 2006; ASSIS et al. 2021). Os SABs podem ser formados pela combinação de certos sais inorgânicos e soluções aquosas de certos polímeros solúveis em água em concentrações específicas, sendo que os sistemas obtidos são compostos por duas fases aquosas imiscíveis entre si, onde a fase superior é rica em polímero e a fase inferior rica em sal, sendo que ambas as fases são formadas majoritariamente por água. Nesta técnica a fase polimérica desempenha papel semelhante à de solventes orgânicos usados nos métodos de microextração líquido-líquido tradicionais (BULGARIU e BULGARIU, 2008). Nos SAB`s é possível pré-concentrar o analito variando a razão entre as massas da fase inferior e superior, sendo possível concentrar tanto na fase superior quanto inferior do sistema (ASSIS et al. 2019; NEVES et al. 2020). A aplicação do SAB como uma metodologia de pré-concentração ainda é pequena, poucos trabalhos são encontrados na literatura. Neves e colaboradores determinaram cádmio e manganês em amostras de alimentos com a pré-concentração ocorrendo na fase inferior do sistema, rica em sal, sem uso de agente complexante (NEVES et al. 2020). Assis e colaboradores determinaram arsênio (III) na fase superior do SAB usando APDC como complexante (ASSIS et al. 2019). O objetivo deste estudo é o desenvolvimento de uma metodologia analítica para a determinação de vanádio em amostras de alimentos usando espectrometria de absorção 91 atômica (FAAS), precedido de uma pré-concentração dos íons V(V) em sistema aquoso bifásico formado por (NH4)2SO4 + PEG400 + H2O na presença do complexante Br- PADAP. As variáveis experimentais que afetam a extração de vanádio, como pH, concentração do agente complexante, tempo de repouso em banho termostático e centrifugação foram otimizadas e avaliadas de forma multivariada. Finalmente, a metodologia otimizada foi aplicada com sucesso para análise de vanádio (V) em diferentes amostras de alimentos. 92 2. Parte Experimental 2.1. Reagentes Os componentes formadores do sistema aquoso bifásico foram sulfato de amônio e polietileno glicol 400 g.mol-1 (PEG400) obtidos da Synth, Brasil. Para ajuste de pH foi utilizado hidróxido de potássio adquirido da ISOFAR, Brasil, para digestão das amostras, ácido nítrico comprado da Sigma Aldrich, EUA e peróxido de hidrogênio da Dinâmica, Brasil. Os reagentes complexantes Br-PADAP (2-(5 Bromo-2-pyridylazo)-5- (diethylamino)phenol), TAC (2-(2-Thiazolylazo)-p-crsol), PAN (Piridil-Azo-Naftol), TAN (1-(2-Thiazolylazo)-2-naphtol), PAR (4-(2-Piridil-Azo) Resorcina monossódica), TAR (4-(2-Thiazolylazo)resorcinol) e a amostra certificada (NIST 1515-Apple Leaves), foram fornecidos pela Sygma Aldrich, EUA. Todos os ensaios foram realizados com água deionizada (MILI-Q R≥ 18 MΩ cm-1) 2.2. Instrumentação Para preparo do SAB utilizou-se uma balança analítica (Celtac FA-2104 N) com incerteza de 0,0001g e uma centrífuga (Hettich Rotofix 32A). Para que se alcançasse o equilíbrio térmico do sistema foi necessário o uso de banho ultra-termostatizado (TECNAL TE-0541), utilizou-se um pHmetro (GEHAKA) para ajuste de pH das amostras e um agitador magnético (Vertex 78HN-1) para a solubilização dos componentes do SAB. A digestão das amostras foi realizada em um bloco digestor (TECNAL TE-007 MP) e para detecção de vanádio presente nas amostras foi usado o espectrômetro de absorção atômica com chama de óxido nitroso/acetileno (FAAS- Analytik Jena, novAA 300). 2.3. Metodologia 2.3.1. Preparação do Sistema Aquoso Bifásico Em um tubo de ensaio de 15,0 mL foram adicionados 0,100 g de H2O com pH ajustado a 3,60, mais 13,4 g de solução de sulfato de amônio 40 %m/m em pH 3,60 e 0,430 g de PEG400 contendo Br-PADAP. O tubo foi agitado vigorosamente de forma manual e então levado para centrifugação para acelerar a separação de fases. Em seguida foi levado para o banho ultra-termostatizado a 25oC por 2,12hs para que as fases alcançassem o equilíbrio térmico. Decorrido este tempo uma alíquota da fase superior foi 93 retirada, diluída duas vezes e levada para detecção de vanádio no FAAS. Na aplicação nas amostras, o digerido com pH ajustado, foi utilizado como solvente na preparação da solução de sulfato de amônio e como água no sistema. A Fig 2.1 (I) ilustra todas as etapas da metodologia e a Fig 2.1 (II) mostra uma imagem do sistema depois que o complexo se forma e é extraído para fase superior. Figura 2.1 - Esquema do procedimento de extração e pré-concentração na fase superior usando SAB (I) e separação de fases com formação do complexo na fase superior (II). Fonte: próprio autor 2.3.2. Otimização multivariada A otimização das variáveis experimentais foi realizada em duas etapas. Na primeira etapa, um planejamento fatorial de dois níveis com três pontos centrais foi aplicado, para triagens das variáveis que mais influenciam a extração e pré-concentração de vanádio no SAB. As variáveis avaliadas foram pH, concentração de complexante (Br- PADAP), tempo de centrifugação e tempo de banho ultra-termostatizado. O planejamento é mostrado na tabela 2.1. 94 Tabela 2.1 - Matriz do planejamento fatorial 24 com resultados. Exp. Variáveis [Br- PADAP] (%) pH Tempo banho UT (horas) Tempo centrifuga (minutos) Resposta (absorvância) 1 - (0,001) - (2,00) - (2,00) - (2,00) 0,0036 2 + (0,005) - (2,00) - (2,00) - (2,00) 0,0049 3 - (0,001) + (8,00) - (2,00) - (2,00) 0,0016 4 + (0,005) + (8,00) - (2,00) - (2,00) 0,0019 5 - (0,001) - (2,00) + (6,00) - (2,00) 0,0030 6 + (0,005) - (2,00) + (6,00) - (2,00) 0,0043 7 - (0,001) + (8,00) + (6,00) - (2,00) 0,0010 8 + (0,005) + (8,00) + (6,00) - (2,00) 0,00090 9 - (0,001) - (2,00) - (2,00) + (8,00) 0,0025 10 + (0,005) - (2,00) - (2,00) + (8,00) 0,0038 11 - (0,001) + (8,00) - (2,00) + (8,00) 0,0019 12 + (0,005) + (8,00) - (2,00) + (8,00) 0,0030 13 - (0,001) - (2,00) + (6,00) + (8,00) 0,0024 14 + (0,005) - (2,00) + (6,00) + (8,00) 0,0050 15 - (0,001) + (8,00) + (6,00) + (8,00) 0,0014 16 + (0,005) + (8,00) + (6,00) + (8,00) 0,0010 17 0 (0,003) 0 (5,00) 0 (4,00) 0 (5,00) 0,0048 18 0 (0,003) 0 (5,00) 0 (4,00) 0 (5,00) 0,0051 19 0 (0,003) 0 (5,00) 0 (4,00) 0 (5,00) 0,0052 Após a definição de quais as variáveis foram significativas, foi realizado a otimização do sistema usando matriz Box-Behnken, como apresentado na tabela 2, para definir quais os pontos ótimos para cada variável. Em uma matriz Box Behnken o estudo de todos os fatores ocorre em três níveis, sendo o modelo definido como N = 2k (k - 1) + Co, onde k é o número de variáveis e Co é o número de pontos centrais (FERREIRA et al. 2019). 95 Tabela -1.2 - Tabela da matriz box-Behnken para três variáveis com resultados Experimentos pH [Br-PADAP] (%) Tempo banho UT (horas) Resposta (absorvância) 1 - (2,00) - (0,005) 0 (2,00) 0,0034 2 +(4,00) - (0,005) 0 (2,00) 0,0023 3 - (2,00) + (0,01) 0 (2,00) 0,0023 4 +(4,00) + (0,01) 0 (2,00) 0,0047 5 - (2,00) 0 (0,075) - (1,00) 0,0019 6 +(4,00) 0 (0,075) - (1,00) 0,0043 7 - (2,00) 0 (0,075) + (3,00) 0,0037 8 +(4,00) 0 (0,075) + (3,00) 0,0043 9 0(3,00) - (0,005) - (1,00) 0,0031 10 0(3,00) + (0,01) - (1,00) 0,0029 11 0(3,00) - (0,005) + (3,00) 0,0040 12 0(3,00) + (0,01) + (3,00) 0,0033 13 0(3,00) 0 (0,075) 0 (2,00) 0,0049 Os experimentos foram realizados de forma aleatória. Os valores de absorbância obtidos para cada experimento foram utilizados como resposta na análise dos dados. O programa Statistica 6.0 foi utilizado para avaliação dos resultados experimentais. 2.3.3. Estudo do efeito da razão mássica e da concentração dos componentes formadores do SAB Para obtenção de uma maior porcentagem de extração (%E), os diversos parâmetros que influenciam na partição do analito no sistema foram avaliados. A equação 2.1 apresenta como a %E é calculada. %E = 𝑛𝑀𝐹𝑆𝑛𝑀𝑡 x 100 Equação 2.1 Onde 𝑛𝑀𝐹𝑆 é o número de mols de vanádio na fase superior e 𝑛𝑀𝑡 é o número de mols total do sistema. 96 Para estudo da razão mássica foi avaliado um SAB com massa total de 14,0 g, onde se avaliou as razões entre as massas da fase inferior e superior de 11/3; 12/2; 13/1 e 13,5/0,5 g/g em dois diferentes comprimentos de linha de amarração: 43,4 e 52,2 %m/m. 2.3.4. Características analíticas Para determinação do limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) foi realizada a leitura de 10 amostras do branco, onde LD foi calculado pela razão de 3 vezes o desvio padrão do branco pela inclinação da curva de calibração e LQ pela razão de 10 vezes o desvio padrão do branco pela inclinação da curva de calibração. Para definição da precisão foram realizadas 8 repetições na concentração de 50,0 μg.kg-1 de vanádio e expressa em desvio padrão relativo (DPR). A linearidade foi estudada com a construção de uma curva de calibração direta na faixa de concentração de 500 a 2500 μg.kg-1 e pré- concentrada de 25,0 a 250 μg.kg-1. O fator de enriquecimento foi calculado pela razão entre a inclinação da curva pré-concentrada e a curva direta, já o fator de pré-concentração foi calculado como a razão entre o volume inicial da amostra e o volume final. Para avaliação de exatidão da metodologia utilizou-se amostra certificada de folhas de maçã (NIST 1515) e após a otimização a metodologia foi aplicada para determinação de vanádio em diversas amostras de alimentos. 2.3.5. Íons Interferentes Foram avaliados os íons que poderiam interferir no sinal analítico considerando uma variação de até 5%. Os íons estudados foram CO32-; Na+; Ca2+; Fe3+; Co2+; Al3+; Zn2+; NO3-; Ni2+; Mo6+; Mn2+; Cl-; Mg2+; Li2+ e PO42-. Os SAB foram preparados com a concentração de vanádio de 50,0 μg kg-1 e os íons interferentes foram adicionados ao sistema em várias concentrações até que houvesse alteração no sinal analítico em relação ao sistema sem a presença destes íons. 2.3.6. Aplicação em amostras reais As amostras de alimentos analisadas foram: leite integral, cogumelo fungi e shitake, arroz integral, chá preto, salsa e aveia. Todas as amostras de alimentos foram adquiridas no comércio local, sendo que amostras de cogumelo, chá preto e salsa já estavam desidratadas. Antes de iniciar o processo de digestão as amostras de arroz 97 integral e cogumelos foram trituradas. Para o processo de digestão foi pesado 0,5g de cada amostra em triplicata e então adicionou-se 3,00 mL de HNO3 concentrado e 2,00 mL de H2O2 e então as amostras foram submetidas ao aquecimento a 150oC em sistema aberto até quase secura. Após a digestão o pH das amostras foi ajustado para 2,00 com KOH a 5,00 mol.L-1 e avolumada para 10,0 mL. Foi aplicada a metodologia desenvolvida em cada amostra e também feita a adição de 50,0 e 100 µg kg-1 de vanádio e os resultados avaliados através dos valores de recuperação obtidos. A amostra certificada NIST 1515 passou pelo mesmo procedimento de digestão diferindo apenas na massa pesada da amostra que foi de 1,00 g e digerida com 4,00 mL de HNO3 e 4,00 mL de H2O2. O pH foi ajustado para 2,00, porque após a adição de sulfato de amônio a solução final fica com pH 3,60. 98 3. Resultados e Discussão Geralmente, para atingir níveis significativos de extração de íons metálicos para a fase polimérica do SAB é necessário o uso de um agente complexante. Neste contexto, foram realizados testes preliminares com os complexantes PAR, TAR, TAC, PAN e Br- PADAP, sendo este último o que apresentou maior eficiência de extração (89,4%). O tipo de polímero e sal também foram estudados de forma preliminar, onde observou-se que a fase superior formada por PEG400 possibilitou uma menor diluição da fase rica, já que possui menor viscosidade que as fases formadas por polímeros com massa molar maior. Sistemas formados por PEG400 e sais como fosfato de potássio (XIE, et al. 2010), sulfato de sódio e de amônio (MARTINS et al. 2010) já foram caracterizados. Dentre os sais avaliados, considerando a mesma razão de massa entre as fases, o sulfato de amônio apresentou menor volume de fase superior permitindo uma maior pré-concentração do íon metálico e, além disso, o sistema ((NH4)2SO4 + PEG400 + H2O) se comportou de forma satisfatória quanto a manutenção do pH desejado até o final do procedimento experimental. Assim, o sistema aquoso bifásico formado por (NH4)2SO4 + PEG400 + H2O caracterizado anteriormente por Murari e colaboradores (MURARI et al. 2015) foi utilizado para extrair e pré-concentrar vanádio na fase superior rica em polímero. 3.1. Otimização multivariada Na primeira etapa, foi realizado um planejamento fatorial de dois níveis para 4 variáveis, onde foram estudados pH, concentração de complexante, tempo de banho ultra- termostatizado e tempo de centrifugação, de acordo com a Tabela 2.1. O resultado obtido está representado na figura 2.1, através do gráfico de Pareto. No gráfico de Pareto o comprimento da barra será proporcional a influência da variável no sinal analítico, já o sinal positivo ou negativo indica se aquela variável tende para o nível inferior ou superior das variáveis. É possível observar ainda, que há uma linha de referência no gráfico, onde se observa que quando a barra excede esta linha a variável em questão é significativa, além disso ela delimita o nível de probabilidade que é de 0,05 (SOUZA et al. 2017). 99 Figura 2.2 - Gráfico de Pareto para planejamento fatorial de dois níveis. Analisando o gráfico de Pareto observa-se que pH, concentração de complexante e tempo de banho ultra-termostatizado são variáveis significativas para a extração de vanádio no SAB, sendo que pH e tempo de banho ultra-termostatizado tendem para o nível inferior e concentração de complexante para o nível superior. O tempo de centrifugação não foi significativo. Dessa forma, o valor desta variável foi fixado no nível mínimo (2,00 minutos a 400 RPM) aumentando assim a frequência analítica. As variáveis estudadas exercem forte efeito no processo de extração dos íons metálicos para a fase superior do sistema. A princípio, os íons metálicos se concentram na fase inferior do SAB, onde as interações do tipo íon-íon e íon-dipolo são favorecidas. Além disso, esses íons possuem forte tendência de hidratação e, consequentemente, se concentram na fase com maior teor de água (FI). Assim, para o íon metálico ser transferido para a fase superior é necessário diminuir sua tendência de hidratação, o que é feito através de sua complexação. O complexo metálico formado possui menor valor de energia livre de hidratação e, portanto, se direciona para a fase com menor conteúdo de água (FS). Na figura 2.3, é possível ver a estrutura do complexante Br-PADAP que é um ligante tridentado que se liga ao vanádio através de ligações com nitrogênio e oxigênio. 100 Figura 2.3 – Estrutura química do complexante Br-PADAP Para que este processo seja favorecido é necessário que o complexo formado seja estável e que a maior parte dos íons metálicos sejam complexados, por isso as variáveis pH e concentração de complexante se mostraram tão significativas. O efeito do tempo de banho ultra-termostatizado também foi significativo pois a temperatura é um fator essencial no equilíbrio líquido-líquido do SAB, e, é necessário um tempo mínimo para a completa separação das fases. Para segunda etapa de otimização foi levada em consideração as variáveis significativas do planejamento fatorial. Dessa forma, uma matriz Box-Behnken para 3 variáveis foi utilizada para a definição dos pontos ótimos para a extração e pré- concentração de vanádio. Os dados obtidos na execução dos experimentos que compõem esta matriz Box- Behnken geraram as superfícies de resposta e os gráficos das curvas de níveis apresentados na figura 4. Esta superfície de resposta pode ser descrita pela equação 1 a qual relaciona o pH, concentração complexante (CC) e temperatura do Banho Maria (TBM) com a resposta analítica. 101 Figura 2.4- Superfícies de resposta para o planejamento Box-Behnken: Análise de concentração de Br-PADAP e tempo de banho-ultra-termostatizado (I), pH e tempo de banho-ultra-termostatizado (II) pH e concentração de Br-PADAP (III). I II III 102 A equação abaixo ilustra a relação das três variáveis, pH, concentração do complexante (CC), tempo de banho ultra-termostatizado (TBM) e a resposta analítica (SA). (SA) = - 0,0092 + 0,0021 (pH) + 0,1350 (CC) + 0,0048 (TBM) + 0,0007(pH)2– 1,6800(CC)2 - 0,0008 (TBM)2+ 0,0400 (pH)(CC) – 0,0003 (pH)(TBM) – 0,0020(CC)(TBM) Equação 2.2 A derivação da equação acima em função das três variáveis resulta no sistema de equações abaixo: δ(SA)/δ(pH) = 0,0021+ 0,0014(pH) +0,0400 (CC) – 0,0003(TBM) Equação 2.3 δ(SA)/δ(CC) = 0,1350 +0,0400 (pH) - 3,3600(CC)– 0,0020 (TBM) Equação 2.4 δ(SA)/δ(TBM) = 0,0048 – 0,0003(pH) – 0,0020 (CC) – 0,0016 (TBM) Equação 2.5 A partir do sistema formado pelas equações 2.3, 2.4 e 2.5 foi possível calcular os pontos críticos para as variáveis estudadas, sendo estes: pH 3,60; CC 0,008%; TBM 2,12 h em valores reais. Estes valores foram usados nos estudos posteriores. 3.2. Razão mássica e melhor CLA Os comprimentos de linha de amarração estudados foram 43,4 e 52,2 %m/m nas razões mássicas entre a fase superior e inferior de 0,270; 0,160; 0,0760 e 0,0370. A figura 2.5 mostra os valores de %E obtidos nas condições avaliadas. 103 Figura 2.5 - Porcentagem de extração de V(V) em função da razão de massa entre as fases no CLA = 43,4 m/m (▪) e CLA 52,2 m/m (•) Observa-se na Figura 3 que os valores de %E variam entre as CLA`s quando comparamos valores de razão mássica iguais, sendo que os maiores valores de %E são alcançados no sistema com maior valor de CLA. Isso ocorre pois à medida que o valor de CLA aumenta, cresce também a diferença entre as composições das fases superior e inferior do sistema (propriedades termodinâmicas intensivas), assim haverá uma maior quantidade de polímero na fase superior e maior quantidade de sal na fase inferior (ASSIS et al. 2019). Neste contexto, o complexo metálico tenderá a particionar para fase superior em uma extensão maior à medida que aumenta o valor do CLA, já que esta fase estará mais concentrada nos componentes com os quais suas interações são mais favoráveis (VECINO et al. 2012). A razão mássica de 0,0320 na CLA 52,2 %m/m foi escolhida pois apresenta maior porcentagem de extração, possibilitando um maior fator de enriquecimento e pré-concentração. Ademais, devido a maior concentração de componentes formadores do SAB no CLA maior, o sistema torna-se mais robusto já que ponto de composição global estará mais distante da linha binodal no seu diagrama de fases. 3.2.1. Íons Interferentes Para estudo da seletividade e aplicabilidade da metodologia de pré- concentração usando sistema aquoso bifásico foram adicionados, individualmente os íons que comumente são encontrados simultaneamente ao analito em amostras de alimentos. 104 O efeito da presença do interferente na intensidade do sinal analítico foi investigado nas condições otimizadas usando uma solução de 50,0 µg kg-1 de V(V), adicionando-se diferentes concentrações dos íons concomitantes até uma interferência máxima de ± 5%. Na tabela 2.3 está descrito os valores (mol/mol) limites que não houve interferência. Tabela 2.3 - Limite máximo de íons interferentes tolerados no sistema aquoso bifásico para determinação de vanádio Íon interferente Razão (mol/mol) Recuperação (%) CO32- 1000 96,0% Na+ 1000 91,0% Ca2+ 100 95,0% Fe3+ 50,0 92,0% Co2+ 100 98,0% Al3+ 1000 101% Zn2+ 50,0 97,0% NO3- 1000 92,0% Ni2+ 50,0 99,0% Mo6+ 1000 98,0% Mn2+ 100 100% Mg2+ 1000 96,0% Li2+ 50,0 95,0% PO42- 1000 95,0% Os íons interferentes avaliados podem ser encontrados conjuntamente ao vanádio em diversos tipos de amostras. Eles podem influenciar na %E de extração do analito de duas formas principais: i. alterar o equilíbrio de fase do sistema e consequentemente influenciar na transferência do complexo para a fase superior (principalmente os ânions e os íons metálicos alcalinos); ii. competir com o vanádio para ser complexado pelo Br- 105 PADAP (metais de transição) ou competir com o Br-PADAP pela complexação do vanádio (ânions). De acordo com a tabela, é possível observar que o método apresenta boa seletividade frente aos efeitos de matriz, sendo que as concentrações dos interferentes em que o método apresenta boa exatidão está acima dos teores normalmente encontrados em diversas amostras diferentes. 3.3. Características analíticas Após a otimização das variáveis que interferem na metodologia analítica proposta, foram determinadas as figuras de mérito como faixa linear, limite de detecção, limite de quantificação, precisão (desvio padrão relativo), fator de enriquecimento, fator de pré- concentração e exatidão. A faixa linear estudada para uma curva analítica com leitura direta foi de 50 a 250 μg kg-1 (y = 4,57x10-5 x + 2,12x10-5) e com pré-concentração de 2,5 a 25 µg kg-1 (y = 8,7x10-4x – 1,63 x 10-4). O limite de detecção e quantificação calculados foram de 0,0220μg kg-1 e de 0,665μg kg-1, respectivamente. A precisão foi avaliada com oito repetições na concentração de Vanádio de 100μg kg-1 alcançando um valor de 2,51%. O fator de enriquecimento obtido foi de 19,1. A exatidão foi avaliada através da aplicação da metodologia em material de referência certificado de folha de maçã NIST 1515 com valor certificado de 254 µg kg-1 ± 0,027 e o valor encontrado foi de 246 µg kg-1 ± 0,08 com recuperação de 94,1%, o que demonstra uma boa exatidão do método. Figura 2.6 – Curva de calibração direta (■) e pré-concentrada (•) para vanádio 106 3.4. Aplicação em amostras Reais A metodologia foi aplicada em diferentes amostras de alimentos. Além da determinação de vanádio nas amostras, um teste de adição e recuperação foi feito, sendo adicionados 50 e 100µg kg-1 de vanádio às amostras, como mostrado na tabela 2.4. Tabela 2.4 - Determinação de V(V) em amostras de alimentos após pré-concentração usando sistema aquoso bifásico Amostra Quantidade adicionada (µg kg-1) Quantidade encontrada (µg kg-1) Recuperação (%) Arroz integral - ND - 50,0 52,0± 0,01 104 ± 2,0 100 98,3 ± 0,05 98,3 ± 0,80 Chá preto - ND - 50,0 50,3 ± 0,09 100 ± 1,9 100 93,8 ± 0,03 93,8 ± 0,7 Salsa - ND - 50,0 0,0510 ± 0,011 102 ± 2,2 100 108 ± 0,035 108 ± 3,5 Leite - ND - 50,0 48,7 ± 0,012 97,4 ± 1,8 100 98,4 ± 0,02 98,4 ± 0,2 Cogumelo Shitaki - ND - 50,0 47,3 ± 0,019 94,7 ± 3,9 100 95,3 ± 0,025 95,3 ± 2,8 Cogumelo Fungi - ND - 50,0 48,8 ± 0,042 97,6 ± 1,6 100 102 ± 0,022 102 ± 2,7 Aveia - ND - 50,0 52,6 ± 0,011 105,5 ± 1,8 100 97,0 ± 0,09 97 ± 0,95 107 Os valores de recuperação obtidos ficaram ente 93,8 a 108% para as amostras certificadas. Já para as amostras de alimentos analisadas, a presença de vanádio está abaixo do limite de detecção do método. 108 4. Conclusão Os resultados alcançados neste trabalho demonstram que a combinação da utilização da técnica de sistema aquoso bifásico para pré-concentração do analito com posterior detecção com FAAS pode ser usado para determinação de vanádio em amostras de alimentos. Excelentes valores de exatidão com recuperação de 94,1% para aplicação em material de referência certificada (NIST 1515), LD de 0,0220 µg kg-1, LQ de 0,665 µg kg-1 e precisão de 2,51% foram alcançados. O método foi aplicado de forma satisfatória em diversas amostras de alimentos para detecção de níveis traço de vanádio, sendo uma nova alternativa para a detecção deste analito em matrizes complexas. O sistema proposto possui diversos benefícios como eliminação do uso de solventes orgânicos, baixo custo, bons valores de sensibilidade, seletividade e fator de enriquecimento. 109 5. Referências Bibliográficas ANKE, Manfred. Vanadium-an element both essential and toxic to plants, animals and humans. 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Razão mássica e comprimento da linha de amarração foram avaliados de forma univariada. Os resultados mostraram que as condições experimentais ótimas foram em pH = 9,20, tempo de centrifugação = 10,0 min, tempo de banho ultra-termostatizado = 11 h e concentração de PAR = 0,0750 %m/m. Os valores de LD foram de 0,330 e 0,0370 µg kg-1; LQ de 1,10 e 0,890 µg kg-1 para cobalto e níquel, respectivamente. Fator de enriquecimento de 20,2 para Co e 16,7 para Ni; para a precisão (RSD), na concentração de 50,0 µg kg-1 de cobalto e níquel, foram encontrados valores de 6,32% e 7,37%, respectivamente. A exatidão foi avaliada com aplicação em amostra certificada NIST 1515 com recuperação de 97,6 e 97,9%, e recuperação entre 96,6 e 106% para amostras de alimentos para Co e Ni respectivamente. Os resultados obtidos demostram que este é um método promissor para determinação de Co e Ni em diversas amostras de alimentos. Palavras-chave: Cobalto; níquel; pré-concentração, sistema aquoso bifásico 113 1. Introdução A definição de toxicidade de um metal no organismo humano depende da sua concentração, já que qualquer elemento pode ser considerado potencialmente tóxico em quantidade elevada (ARPA et al. 2019), como por exemplo o cobalto e níquel. Cobalto está associado a vitamina B12 e é importante na prevenção de anemia perniciosa, sua deficiência está associada a distúrbios hepáticos, pancreáticos e do sistema nervoso e seu excesso causa sintomas tóxicos como vasodilatação, hipotireoidismo, neuropatia, deficiência auditiva ou visual e cardiomiopatia. Já o níquel está presente nos sítios ativos de algumas enzimas e em quantidades elevadas no organismo pode causar dores de estômago, doenças renais, cardiovasculares, dermatite de contato e doenças do sistema respiratório como lesões pulmonares (SIMONSEN et al. 2012; ARAIN et al. 2016; ARPA et al. 2019; KOOSHA et al. 2018; ELIK et al. 2020; ERLUAS et al. 2020) Umas das técnicas mais utilizadas para determinação de Co e Ni em diversos tipos de amostras é a espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS). Embora seja uma técnica amplamente utilizada na determinação de íons metálicos e que tenha custo baixo, operação simples e a alta frequência analítica, possui uma sensibilidade insuficiente para determinação desses analitos em amostras de alimentos. Com isso não é viável a determinação direta devido aos baixos níveis destes analitos na amostra e também devido a influência sofrida em decorrência aos interferentes presentes na matriz. Assim, etapas de separação e pré-concentração se tornam necessárias para que se alcance maior seletividade e sensibilidade (CITAK et al. 2010; DIAS et al. 2020). Diante dos esforços enveredados para uma química mais sustentável é interessante que as metodologias analíticas contemplem os aspectos relacionados a química verde. Estudos envolvendo desenvolvimento de métodos analíticos tem se preocupado cada vez mais em diminuir o uso de produtos químicos que prejudiquem a saúde e o meio ambiente. Neste contexto os SAB`s são excelentes alternativas para o preparo de amostras, pois é uma técnica que apresenta vantagens como facilidade de preparação, não utiliza solventes orgânicos, baixo custo, alto teor de água, baixa tensão interfacial e alta seletividade (SALABAT et al. 2011; LIU et al. 2016; HAMTA et al. 2017). A extração de cobalto e níquel usando sistemas aquosos bifásicos já é bastante descrita na literatura (PATRICIO et al. 2011; RODRIGUES et al. 2013; CHEN et al. 2018 e VALADARES et al. 2018) e com excelentes resultados, porém a pré-concentração simultânea destes metais 114 utilizando SAB não é relatada, assim como aplicação em amostras de alimentos e a utilização de surfactantes como componente formador do sistema. Dentre os componentes formadores dos SAB´s podemos destacar os polímeros, sais orgânicos e inorgânicos, surfactantes, líquidos iônicos, álcoois, entre outros (SALABAT et al. 2011; LIU et al. 2016). Sendo que existem poucas publicações abordando aplicações dos SAB´s formados por surfactante, sal e água. Porém se trata de um sistema versátil que possibilita a modulação das características das fases. Estes sistemas são semelhantes aos formados por polímeros, sal e água em que se tem cada uma das fases rica em um soluto. A separação de fases em um SAB formado por surfactante e sal é um processo termodinâmico complexo afetado pela temperatura, tipo e concentração de sal, tipo e concentração de surfactante (SALABAT et al. 2011; LIU et al. 2016; CRUZ SILVA et al. 2020). Como característica geral, os tensoativos têm a capacidade de formar micelas, podendo ser usados em SAB´s para a extração de analitos hidrofóbicos. Além das vantagens já citadas para SAB´s de um modo geral, os formados por surfactantes têm adicionalmente benefícios como menor tensão interfacial quando comparado a outras composições de SAB e menor quantidade de sal inorgânico necessária para induzir a separação de fases. Dentre os tensoativos da família Triton X, o Triton X-100 é o mais comumente utilizado para diversas aplicações analíticas (ALVAREZ et al. 2012; E SILVA et al. 2021). Na última década, a possibilidade de utilização de surfactantes em sistemas aquosos bifásicos para extração e separação de espécies químicas tem expandido as possibilidades de aplicação dos SAB´s, os quais possuem propriedades distintas, aumentando a versatilidade desses sistemas (LIU et al. 2016; FIGUEREDO et al. 2021), como o sistema formado por triton X-100 e sulfato de amônio para extração de tungstênio (VI) na fase inferior do sistema, rica em sal, sem uso de agente complexante ( ZHANG et al. 2016). Com as vantagens apresentadas pelos SAB que utilizam surfactantes e a necessidade de desenvolver um método simples, sensível, seletivo e barato para a determinação e monitoramento contínuo de metais em amostras de alimentos, neste trabalho é proposto uma metodologia de pré-concentração simultânea de cobalto e níquel em um sistema aquoso bifásico formado por surfactante, sal e água, a partir de amostras de alimentos. Fatores como pH, concentração de agente complexante, tempo de banho ultra-termostatizado e tempo de centrifugação serão avaliados em função da eficiência de extração dos analitos. Figuras de mérito analítica serão obtidas a fim de validar o método proposto. 115 2. Procedimento Experimental 2.1. Reagentes Foram utilizados para os experimentos de formação do sistema aquoso bifásico TRITON X-100 (Sygma–Aldrich), sulfato de amônio ((NH4)2SO4), citrato de sódio (Na3C6H5O7) e sulfato de sódio (Na2SO4) fornecidos pela Synth-Brasil, a água utilizada foi deionizada (MILI-Q R≥ 18 MΩ cm-1), além de solução padrão (1000 mg kg-1) de cobalto e níquel (Sygma-Aldrich). Foi utilizado para ajuste de pH o hidróxido de potássio (ISOFAR - Brasil). Ácido nítrico (HNO3 - 65%) (Sygma-Aldrich) e peróxido de hidrogênio (H2O2 - 35%) (Dinânica, Brasil) foram utilizados para digestão das amostras. O reagente complexante PAR (4-(2-Pyridylazo) resorcinol) e a amostra certificada (NIST 1515-Apple Leaves) foram fornecidos pela Sygma-Aldrich. Todos os reagentes eram de qualidade analítica e foram utilizados como recebidos do fabricante, sem purificação adicional. Toda vidraria utilizada foi deixada em banho de ácido nítrico a 10% por 24 horas e em seguida lavada com água deionizada. 2.2. Instrumentação Uma balança analítica (Celtac FA-2104 N) com incerteza de 0,0001g foi utilizada para preparo do SAB e para acelerar a separação de fases foi utilizada uma centrífuga (Hettich Rotofix 32A). Para alcance do equilíbrio térmico do sistema utilizou-se um banho ultra-termostatizado (TECNAL TE-0541), para ajuste de pH das amostras um pHmetro (GEHAKA) e para a solubilização dos componentes do SAB um agitador magnético (Vertex 78HN-1). Para a abertura das amostras foi utilizado micro-ondas (PROVECTO ANALITICA DGT 100 plus) e para detecção de cobalto e níquel foi utilizado um espectrômetro de absorção atômica com chama (FAAS- Analytik Jena, novAA 300). 2.3. Metodologia Em um tubo de 15,0 mL adicionou-se 2,09 g de solução de Triton X-100 a 20,0 %m/m contendo PAR a 0,0750 %m/m + 8,75g de solução de sulfato sódio a 18,0 %m/m e 3,15 g de água, todos com pH ajustado a 9,20. Em seguida o tubo foi agitado manualmente para contato entre os componentes do sistema e depois levado para centrifugação por 5 minutos a 4000 rpm. Após a etapa de centrifugação os tubos foram levados ao banho ultra-termostatizado a 293,15K por 11,2 horas. Decorrido este tempo, 116 uma alíquota da fase superior foi retirada e diluída com água em um fator de cinco vezes e então a intensidade do sinal analítico para cobalto e níquel foi medido no FAAS. O esquema geral para o procedimento está representado na Figura 3.1. Figura 3.1 – Esquema com etapas da metodologia de extração e pré-concentração de cobalto e níquel em um SAB (I) usando PAR como complexante (II) 2.3.1. Otimização multivariada Duas etapas foram realizadas para otimização multivariada das variáveis experimentais. Para a definição de quais variáveis influenciariam na extração e pré- concentração de cobalto e níquel no SAB um planejamento fatorial de dois níveis para 4 variáveis foi aplicado. As variáveis estudadas foram pH, concentração de complexante (PAR), tempo de banho ultra-termostatizado e tempo de centrifugação. Para otimização dos pontos críticos das variáveis estudadas uma matriz Box- Behnken foi utilizada. Os experimentos foram realizados em ordem aleatória. O programa Statistica 6.0 foi utilizado para avaliação dos resultados experimentais. Nas duas etapas, planejamento e otimização, os dois metais foram otimizados simultaneamente usando a função desejabilidade. Esta função permite combinar as respostas individuais (DI) de cada analito em uma única resposta (CANDIOTI et al, 2014). As desejabilidades individuais e a desejabilidade global (DG) são calculadas 117 usando as equações 3.1 e 3.2. Esse método foi desenvolvido na década de 80 por Derringer e Suich (Brown et al, 2009). 𝐷𝑖 = { 0 se 𝑦𝑖 < 𝐿𝑖( 𝑦𝑖−𝐿𝑖𝑈𝑖 −𝐿𝑖)𝑠 se 𝐿𝑖 ≤ 𝑦𝑖 ≤ 𝑈𝑖1 se 𝑦𝑖 > 𝑈𝑖 Equação 3.1 𝐷𝐺 = √𝑑𝐶𝑜 ∙ 𝑑𝑁𝑖2 Equação 3.2 No cálculo da desejabilidade individual foi atribuído como Li, o valor mínimo dos resultados de absorbância e como Ui o valor máximo dos resultados de absorbância obtido e o s foi admitido como 1. Dessa forma, a equação 1 foi reduzida a equação 3.3. A equação 3 foi aplicada para cada analito, separadamente. 𝑑 = 𝑦𝑖−𝐿𝑖𝑈𝑖 −𝐿𝑖 Equação 3.3 2.3.2. Características analíticas As características analíticas necessárias para a validação da metodologia foram determinadas. O limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) foram verificadas através da leitura de 10 brancos, onde LD é calculado pela razão de 3 vezes o desvio padrão do branco pela inclinação da curva de calibração e LQ pela razão de 10 vezes o desvio padrão do branco pela inclinação da curva de calibração. Para definição da precisão foram realizadas 8 repetições na concentração de 50,0 μg kg-1 de cobalto e níquel e expressa em desvio padrão relativo (DPR). A linearidade foi estudada com a construção de uma curva de calibração de 25,0 a 250 μg kg-1 para níquel e de 50,0 a 250 μg kg-1 para cobalto. O fator de enriquecimento foi calculado pela razão entre a inclinação da curva pré-concentrada e a curva direta. Para avaliação de exatidão utilizou-se amostra certificada de folhas de maçã (NIST 1515) e após a otimização a metodologia foi aplicada para determinação de cobalto e níquel em amostras de amendoim, avelã, camarão, amido e farinha de milho. 118 2.3.3. Razão mássica e melhor CLA Para estudo da razão mássica foi utilizado um SAB com massa total de 14.0 g, onde se avaliou as razões massa FI/massa FS de 12,5/1,5; 12/2; 11,5/2,5 e 13/1 nos seguintes valores de CLA: 14,5; 18,9; 23,3 e 27,7 %m/m. 2.3.4. Estudo de íons interferentes Foram avaliados os íons que poderiam interferir no sinal analítico considerando uma variação de até 5%. Os íons estudados foram CO32-; Na+; Ca2+; Fe3+; Co2+; Al3+; Zn2+; NO3-; Ni2+; Mo6+; Mn2+; Cl-; Mg2+; Li2+ e PO42-. Foram preparados sistemas com a concentração de cobalto e níquel de 50,0 μg kg-1 e os íons interferentes foram adicionados ao sistema em várias concentrações até que houvesse alteração no sinal analítico em relação ao sistema sem a presença destes íons. 2.3.5. Aplicação em amostras reais As amostras de amendoim, avelã, camarão, amido e farinha de milho foram adquiridas no comércio local e já se encontravam desidratadas. Antes de iniciar o processo de digestão as amostras foram trituradas. Para a digestão foi pesado 0,200 g de cada amostra em triplicata e então adicionou-se 2,00 mL de HNO3 concentrado, 1,00 mL de água e 2,00 mL de H2O2, então as amostras foram levadas ao micro-ondas com a seguinte programação: 160W por 5 minutos; 300W por 2 minutos e 100W por 3 minutos. Após o processo de digestão o pH das amostras foi ajustado para 9,20 com KOH a 5,00 mol.L-1 e avolumada para 20,0 mL. Um branco e a amostra certificada NIST 1515 passaram pelo mesmo procedimento de digestão diferindo apenas na massa pesada da amostra certificada que foi de 0,500 g e digerida com 4,00 mL de HNO3 e 2,00 mL de H2O2. Para o preparo das soluções de Triton X-100 e sulfato de sódio a amostra foi utilizada como solvente e também utilizada no lugar da água adicionada ao sistema. 119 3. Resultados e Discussão Estudos preliminares com alguns sistemas aquosos formados com Triton X-100 foram avaliados afim de definir qual SAB seria usado para extrair e pré-concentrar íons cobalto e níquel na fase rica em surfactante. O sulfato de sódio foi o sal que apresentou melhor capacidade de manutenção de pH no valor desejado após a separação de fases e o complexante PAR foi o que apresentou melhor eficiência de extração dos analitos. Um sistema formado por Triton X-100 + Na2SO4 + H2O à temperatura de 293,15 K (LIU et al. 2016) foi usado como sistema para pré-concentração de cobalto e níquel. O Triton X-100 é um tensoativo não iônico que possui caráter anfifílico e por isso é excelente para ser usado na extração de analitos hidrofóbicos e hidrofílicos. Como a partição de um soluto no SAB ocorre devido à diferença na hidrofobicidade das fases superior e inferior, tem-se uma das fases com características mais hidrofóbicas (FS) e outra fase com características mais hidrofílicas (FI). O complexo formado pelo analito e complexante irá particionar para uma fase com características semelhantes (Da CRUZ SILVA et al. 2020), no caso a fase rica em surfactante. Os complexos Co-PAR e Ni-PAR têm caráter hidrofóbico e podem ser solubilizados nas micelas formadas pelo Triton X- 100 (MANDAL et al. 2022). A transferência de um íon metálico da fase inferior do SAB para a fase superior está intrinsecamente relacionada a dois processos: (i) a competição entre o extrator e o ânion do eletrólito formador de fase para complexar o metal e (ii) a partição subsequente do complexo para a fase superior do sistema (RODRIGUES et al. 2013). O complexante PAR é um ligante tridentado que forma complexo com cobalto e níquel através do grupo orto-hidroxila, o nitrogênio azo mais próximo do anel fenólico e o átomo de nitrogênio heterocíclico, formando dois anéis quelatos de 5 membros estáveis como demostrado na figura abaixo. (PYTLAKOWSKA et al. 2013). Figura 3.2 - Equação química de formação do complexo entre o complexante PAR e o íon metálico + M ⇋ H+ 120 Após estes estudos iniciais, alguns parâmetros que afetam a formação do complexo e extração do mesmo como pH, tempo de centrifugação, tempo de banho ultra- termostatizado e concentração de complexante foram otimizados em uma abordagem multivariada, já escolha do melhor CLA e razão mássica foi otimizada de forma univariada. 3.1. Análise Multivariada A primeira etapa da análise multivariada foi realizada através de um planejamento fatorial de dois níveis, onde a concentração de complexante, pH, tempo de centrifugação e tempo de banho ultra-termostatizado foram avaliados. Os resultados, em absorvância, foram analisados usando o programa Statistica. Tendo em vista que nesse trabalho foram estudados dois metais, simultaneamente, duas respostas analíticas também foram obtidas simultaneamente e, por consequência, precisavam ser avaliadas. Dessa forma, a função desejabilidade foi utilizada para auxiliar na avaliação dos dados. Nesse caso, cada resposta foi transformada em desejabilidade individual e, em seguida, a desejabilidade global foi calculada. Ambas desejabilidades foram calculadas usando as equações de 3.1 a 3.3 demonstradas anteriormente. A função desejabilidade e outras formas de otimização simultânea para respostas múltiplas pode ser encontrada de forma detalhada no artigo de revisão escrito por Bezerra e colaboradores. O artigo apresenta a função desejabilidade de forma exemplificada podendo ser melhor compreendida (Bezerra et al, 2019). A tabela 3.1 apresenta a matriz de planejamento experimental de dois níveis e os resultados de desejabilidades individuais para cobalto e níquel e a desejabilidade global. 121 Tabela 3.1 - Matriz do planejamento fatorial 24 desejabilidade individuais e global. Exp. Variáveis DI Cobalto DI Níquel DG [] Complexante pH Tempo BM Tempo centrifuga 1 - - - - 0,00443 0,00 0,00 2 + - - - 0,235 0,133 0,176 3 - + - - 0,337 0,215 0,269 4 + + - - 0,876 0,0071 7 0,079 5 - - + - 0,162 0,200 0,180 6 + - + - 0,598 0,322 0,439 7 - + + - 0,969 0,932 0,950 8 + + + - 0,861 0,946 0,902 9 - - - + 0,00 0,0613 0,00 10 + - - + 0,304 0,175 0,231 11 - + - + 0,252 0,243 0,247 12 + + - + 0,505 0,559 0,531 13 - - + + 0,181 0,276 0,223 14 + - + + 0,505 0,391 0,444 15 - + + + 0,737 0,437 0,567 16 + + + + 0,969 1,00 0,984 17 0 0 0 0 1,05 0,606 0,796 18 0 0 0 0 0,984 0,602 0,769 19 0 0 0 0 1,03 0,588 0,778 DI: Desejabilidade Individual. DG: Desejabilidade Global. Analisando os resultados do planejamento fatorial mostrados no gráfico de Pareto (figura 3.3) é possível verificar que para três variáveis a barra extrapola a linha vermelha, o que indica que estas são significativas para a metodologia analítica, sendo elas: concentração de complexante, tempo de banho ultra-termostatizado e pH. Todas elas apresentaram valores positivos, indicando que tendem para o nível superior estudado. 122 Figura 3.3 – Gráfico de pareto para planejamento fatorial de dois níveis 2,338463 23,2681 55,16181 57,10411 p=,05 Efeito estimado (valor absoluto) (4)T Cent (1)Comp (2)pH (3)T BM O tempo de banho ultra-termostatizado foi avaliado na faixa de 2 a 6 horas, sendo que através do gráfico de pareto é possivel observar que esta foi a variável mais significativa e tendendo para o nível superior (6 horas). O pH da solução da amostra é considerado crítico para a formação de um complexo entre os íons metálicos (Co e Ni) e o complexante PAR, sendo avaliado pH de 4 a 10. A diminuição progressiva na extração de íons metálicos em pH 4, ocorre porque o reagente complexante PAR é protonado e a formação do complexo se torna difícil nessa faixa de pH. Por outro lado, em pH 10 a diminuição do sinal analítico ocorre devido à formação de hidróxidos com cátions metálicos. A concentração de PAR foi estudada na faixa de 0,00500 a 0,0200%, sendo que os resultados mostraram que houve uma melhor recuperação de Ni e Co quando a concentração de PAR foi de 0,0200%. Nessa situação há mais PAR disponível para a complexação com os íons metálicos, aumentando a extração dos mesmo para a fase superior. Neste sistema a centrifugação é usada para acelerar a separação das fases, onde foi verificado que a mesma não influenciou significativamente na resposta. O menor tempo de centrifugação avaliado (3,0 min) foi utilizado nos experimentos subsequentes. Após a definição das variáveis significativas, foi realizada a otimização destas variáveis com o objetivo de encontrarmos os valores ótimos. Para tanto, um desenho Box- Behnken foi aplicado. Nesta etapa também se utilizou a desejabilidade global com o 123 objetivo de otimizar os dois analitos simultaneamente. A tabela 3.2 apresenta a matriz Box-Behnken para três variáveis, assim como, as desejabilidades individuais e global. Os resultados são apresentados pelas superfícies de resposta mostradas na figura 3.4 abaixo. Tabela 3.2 - Matriz Box-Behnken para três variáveis para Cobalto e Níquel e desejabilidade individuais e global. Exp. pH [] complexante Tempo BM DI Níquel DI Cobalto DG 1 - - 0 0,000 0,000 0,000 2 + - 0 0,287 0,250 0,268 3 - + 0 0,070 0,169 0,109 4 + + 0 0,776 0,412 0,565 5 - 0 - 0,077 0,199 0,124 6 + 0 - 0,196 0,265 0,228 7 - 0 + 0,406 0,419 0,412 8 + 0 + 0,615 0,640 0,627 9 0 - - 0,531 0,522 0,527 10 0 + - 0,629 0,699 0,663 11 0 - + 0,434 0,735 0,565 12 0 + + 0,944 0,919 0,932 13 0 0 0 1,00 1,00 1,00 14 0 0 0 0,965 0,978 0,971 15 0 0 0 0,972 0,949 0,960 DI: Desejabilidade Individual. DG: Desejabilidade Global. Os valores ótimos para cada uma das variáveis foram determinados a partir da metodologia de superfície de resposta gerada pela matriz Box-Behnken. Os modelos linear e quadrático foram avaliados para observar qual dos modelos matemático melhor se ajustava aos dados gerados pela desejabilidade global. Para garantir a qualidade do modelo escolhido a falta de ajuste foi avaliada. Após avaliação da análise de variância, apresentada na tabela 3.3, observou-se que o modelo quadrático não apresentou falta de ajuste (Fcalculado< Ftabelado). 124 Tabela 3.3 – Análise de variância (ANOVA) para o modelo quadrático ajustado a desejabilidade global ao nível de 95% de confiança. Variáveis SQ gl MQ F calculado p valor (1)pH L+Q 1,177410 2 0,588705 935,6975 0,001068 (2)[] complexante L+Q 0,262104 2 0,131052 208,2964 0,004778 (3)Tempo BM L+Q 0,157052 2 0,078526 124,8105 0,007948 Falta de ajuste 0,065234 6 0,010872 17,2806 0,055706 Erro Puro 0,001258 2 0,000629 Total SQ 1,580623 14 Ftabelado= 19,33. SQ soma quadrática; gl graus de liberdade; MQ Média quadrática. O modelo quadrático gerou a equação 3.4. O critério de Lagrange foi aplicado a equação 3.4 e apresentou uma resposta de máximo para seguintes valores ótimos: concentração de complexante de 0,0710%, tempo de banho ultra-termostatizado de 10,9 horas e pH de 9,10. A equação 3.4 também descrever as superfícies de resposta apresentadas na figura 3.4. DG = - 45,08 (±0,53) + 9,69 (±0,12) pH + 18.39 (± 0,50) PAR + 0,23 (± 0,01)TBM – 0,53 (± 0,01)pH2 - 129,57 (± 4,06)PAR2 - 0,011 (± 0,00) TBM2 Equação 3.4 125 Figura 3.4 - Superfícies de resposta para o desenho Box-Behnken: Análise de tempo de banho ultra-termostatizado e concentração de complexante (I), tempo de banho ultra- termostatizado e pH (II) e concentração de complexante e pH (III). II I II III 126 Com a faixa de pH já mais estreita definida pelo planejamento experimental foram estudados a seguintes faixas: pH 8,00-10,00; tempo de banho ultra-termostatizado 6-12 horas e concentração de complexante de 0,0200-0,100%. A primeira superfície de resposta na figura 4, mostra o tempo de banho-ultratermostatizado e concentração do complexante, a segunda tempo de banho ultra-termostatizado e pH e a terceira concentração de complexante e pH. Analisando estas superfícies é possível verificar que a concentração de complexante tende para o ponto central 0,0710% (m/m), o tempo de banho ultra-termostatizado é de 10,9 horas e o melhor pH é de 9,10. 3.2. Razão mássica e CLA A avaliação da influência do CLA e da razão de massa entre as fases (MFS/MFI) é apresentada na figura 5 para cobalto (I) e níquel (II). Com a definição do melhor sistema de extração usando Triton X-100 e Na2SO4 foram avaliados os CLA´s 14,5; 18,9; 23,4 e 27,7 %m/m com MFS/MFI de 0,0770; 0,120; 0,160 e 0210. Figura 3.5 - Comportamento de extração do Níquel (I) e Cobalto (II) em função da razão de massa entre as fases em CLA = 14,5 (- ■ -), CLA = 18,9 (- ● -), CLA = 23,4 (- ▲ -) e CLA = 27,7 (-▼-) SAB: Triton X-100 + Na2SO4 + H2O à 293,15K. De acordo com os resultados mostrados na Figura 5 é possível observar que não há alterações significativas na %E de cobalto e níquel em função das variações na composição global do SAB. Como os valores de %E foram superiores a 95,0% em qualquer das condições estudadas, foi escolhido o menor CLA porque usa uma menor concentração de sal e Triton X-100 e a razão de massa definida para os próximos I II 127 experimentos foi de 0,160 pois forma um volume de fase superior mais adequado para que seja retirada uma alíquota com facilidade sem contaminação da fase inferior. 3.3. Estudo de íons interferentes A seletividade da metodologia proposta foi avaliada através do estudo de interferentes. Este é um estudo importante para verificar os efeitos de matriz na metodologia desenvolvida. A eficiência da extração foi investigada na presença de vários cátions e ânions comumente existentes em alimentos, onde estes concomitantes foram adicionados à solução da amostra e os limites de tolerância foram determinados para cada íon interferente. A interferência refere-se à competição de outros íons pelo agente quelante e pelo impacto no equilíbrio de fases do SAB, sendo levada em consideração uma variação de 5% no sinal analítico considerando a leitura sem e com a presença do íon interferente. A tabela 3.4 apresenta os resultados encontrados neste estudo. Tabela 3.4 - Limite máximo de íons interferentes tolerados no sistema aquoso bifásico para determinação de cobalto e níquel Íon interferente Razão (mol/mol) Cobalto Razão (mol/mol) Níquel Recuperação (%) CO32- 1000 1000 94,0 – 96,0 Na+ 50,0 50,0 91,0-93,0 Ca2+ 100 100 99,0-101 Fe3+ 100 100 93,0-97,0 Al3+ 1000 1000 95,0-98,0 Zn2+ 100 100 97,0-99,0 NO3- 1000 1000 91,0-95,0 Mn2+ 50,0 50,0 99,0-100 Mg2+ 100 100 96,0% Li2+ 50,0 50,0 95,0% PO42- 1000 1000 95,0% Os resultados apresentados na tabela acima mostram que não houve efeito de interferência significativo. Com isso, pode-se afirmar que processo de extração em 128 condições ótimas é seletivo para Ni (II) e Co (II) e que pode ser aplicado em diversas amostras de alimentos. 3.4. Características Analíticas Após a otimização das condições experimentais foram obtidas as características analíticas. O estudo da linearidade ocorreu na faixa de 25,0 a 250 µg kg-1 para cobalto e níquel, onde foram construídas curvas analíticas direta e pré-concentrada para ambos, gerando a equação da reta e os valores de R2 conforme mostrado nas Figuras 3.6 para níquel e Figura 3.7 para cobalto. Figura 3.6 - Curva de calibração com (●) e sem pré-concentração (■) para níquel Figura 3.7 - Curva de calibração com (●) e sem pré-concentração (■) para cobalto 129 Com as equações geradas pelas curvas direta e pré-concentrada foi possível calcular o fator de enriquecimento que foi de 20,3 para Co e 16,7 para Ni, sendo estes valores próximos aos encontrados em outras metodologias de pré-concentração usando FAAS, como descrito por Dias e Colaboradores (2020), onde estes valores foram 29,0 e 27,0 para cobalto e níquel, respectivamente. Para a análise de precisão (DPR), na concentração de 50,0 µg kg-1 de cobalto e níquel, foram encontrados valores de 6,32% e 7,37%, respectivamente. Os limites de detecção foram de 0,330 e 0,0370 µg kg-1, enquanto que os limites de quantificação foram de 1,10 e 0,890 µg kg-1 para cobalto e níquel, respectivamente. A exatidão da metodologia foi avaliada através da aplicação em amostra de referência certificada de folha de maçã (NIST 1515) com os resultados apresentados na tabela 3.5. Tabela 3.5 - Determinação de Co (II) e Ni (II) pelo método proposto em material de referência certificado NIST 1515 Cobalto Níquel Amostra Valor certificado (µg kg-1) Valor encontrado (µg kg-1) Recuperação (%) Valor certificado (µg kg-1) Valor encontrado (µg kg-1) Recuperação (%) NIST 1515 90,0 ± 0,011 87,6 ± 0,053 97,6 ± 2,7 936 ± 0,094 916 ± 0,028 97,9 ± 2,9 Os valores de recuperação para aplicação da metodologia desenvolvida na amostra certificada foram de 97,6%, mostrando a proximidade entre os valores certificados e os resultados obtidos, demostrando boa exatidão da metodologia desenvolvida. O teste t (nível de confiança de 95%) demonstrou que não houve diferença significativa entre os valores obtidos encontrados após a aplicação do método proposto e os valores certificados. 3.5. Aplicação em amostra real Após a validação, a nova metodologia desenvolvida foi aplicada para a determinação de íons cobalto e níquel em amostras de amendoim, avelã, amido de milho, farinha de milho e camarão. Além disso, foram realizadas a fortificação das amostras com 130 qantidades conhecidas dos metais de estudo (25,0 e 50,0 µg kg-1). Os resultados encontrados e os valores de recuperação para as amostras enriquecidas são apresentados na tabela 3.6. Tabela 3.6 - Determinação de Co (II) e Ni (II) em amostras de alimentos após pré- concentração usando sistema aquoso bifásico Cobalto Níquel Amostra Quantidade adicionada (µg kg-1) Quantidade encontrada (µg kg-1) Recuperação (%) Quantidade adicionada (µg kg-1) Quantidade encontrada (µg kg-1) Recuperação (%) Amendoim - 1,32 ± 0,21 - - 124 ± 0,52 - 25 26,7 ± 0,29 101 ± 1,02 25 158 ± 0,41 106 ± 1,8 50 50,9 ± 0,29 99,3 ± 1,02 50 176 ± 0,09 101 ± 1,36 Avelã - 3,63 ± 0,33 - - 217 ± 0,13 - 25 27,9 ± 0,22 97,4 ± 1,2 25 240 ± 0,28 99,2 ± 0,96 50 54,0 ± 0,22 100 ± 1,4 50 258 ± 0,83 96,6 ± 1,5 Amido de milho - 1,20 ± 0,37 - - 95,9 ± 1,05 - 25 25,9 ± 0,73 98,8 ± 1,8 25 117 ± 0,15 97,4 ± 0,89 50 50,7 ± 0,48 99,0 ± 0,91 50 143 ± 0,52 98,5 ± 0,94 Farinha de milho - ND - - 189 ± 0,47 - 25 25,5 ± 0,69 102 ± 0,88 25 211 ± 1,1 98,3 ± 1,7 50 50,2 ± 0,87 100 ± 1,42 50 237 ± 0,13 98,9 ± 1,4 Camarão - 1,43 ± 0,061 - - 116 ± 0,37 - 25 27,1 ± 0,76 102 ± 0,99 25 142± 0,26 100 ± 0,87 50 52,6 ± 0,91 102 ± 1,12 50 162 ± 0,45 97,4 ± 1,7 131 Os resultados são a média e o desvio padrão de três medidas independentes. Como apresentado, as recuperações das amostras enriquecidas são satisfatórias e apresentam concordância com os valores sem adição do analito. Portanto, a metodologia desenvolvida se mostrou eficiente para a determinação de cobalto e níquel em amostras de alimentos, sendo que não foram utilizados solventes orgânicos contribuindo assim para o desenvolvimento da química sustentável. 132 4. Conclusão Uma nova metodologia usando SAB formado por Triton X-100, Na2SO4 e água foi desenvolvida e validada para determinação de íons cobalto e níquel, simultaneamente, em amostras de alimentos. O estudo das características analíticas mostrou ótimos valores de precisão (6,32% para cobalto e 7,37% para níquel), limite de detecção (0,330 µg kg-1 para Co(II) e 0,0370µg kg-1 para Ni(II)), limites de quantificação ( 1,10 µg kg-1 para Co(II) e 0,89 µg kg-1 Ni(II)), fator de enriquecimento (20,3 e 16,7 para cobalto e níquel respectivamente) e aplicação em amostra certificada com recuperação de 97,8%. Os parâmetros que influenciam na extração foram avaliados de forma multivariada condições ótimas para cada uma obteve-se uma eficiência de extração superior a 95% para ambos os analitos. Esta metodologia foi aplicada em amostras de alimentos como amendoim, avelã, amido de milho, farinha de milho e camarão com resultados satisfatórios, demostrando que é um método eficiente e possibilita uma redução significativa de geração de resíduos químicos tóxicos ao meio ambiente. Além disso, possibilitou o incremento de sensibilidade de uma técnica robusta e de baixo custo como a espectrometria de absorção atômica com chama. Ademais, este é o primeiro trabalho que aplica SAB formado por surfactante em uma metodologia analítica para pré-concentração de íons metálicos na fase superior de um SAB, mostrando a potencialidade deste tipo de sistema. 133 5. Referências Bibliográficas ALTUNAY, Nail; ELIK, Adil; GÜRKAN, Ramazan. 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Com o desenvolvimento de novas metodologias de pré- concentração usando SAB é possível aumentar as possibilidades de determinação de analitos em diversas amostras usando um sistema ambientalmente seguro. Neste trabalho foram realizados estudos no intuito de desenvolver metodologias analíticas explorando toda a versatilidade do SAB para pré-concentrar íons metálicos a partir de amostras de alimentos com detecção por espectrometria de absorção atômica. Especificamente, no capítulo I foi desenvolvido um método para determinação de cádmio e manganês em amostras de chá e café solúvel após a extração e pré-concentração com um SAB formado por PEG 4000 + K2HPO4 + H2O. A pré-concentração ocorreu na fase inferior do SAB sem o uso de nenhum agente complexante. As variáveis massa molar do polímero, tipo de sal e pH foram otimizadas através de análise multivariada usando matriz Doehlert. Foram alcançados limite de detecção de 0,450 e 6,40 µg kg-1, enquanto que os limites de quantificação foram de 1,50 e 21,0 µg kg-1 para cádmio e manganês, respectivamente. A aplicação em amostra certificada apresentou precisão de 98,1% para cádmio e 99,1% para manganês. No capítulo II um sistema formado por PEG 400 + (NH4)2SO4 + H2O foi utilizado para extrair e pré-concentrar vanádio na fase superior do sistema na presença de um agente complexante (Br-PADAP). Parâmetros com pH, concentração de complexante, tempo de banho ultra-termostatizado e tempo de centrifugação foram estudados através de um planejamento Box-Behnken. Os limites de detecção e quantificação encontrados foram de 0,0220 µg kg-1 e 0,665 µg kg-1, respectivamente. A exatidão foi avaliada aplicando a metodologia em amostra certificada de folha de maçã NIST 1515 com recuperação de 94,1%. No capítulo III, um SAB formado por triton X-100 + Na2SO4 + H2O foi usado para pré-concentrar íons cobalto e níquel na fase superior, rica em surfactante, utilizando PAR como agente complexante. Um planejamento Box-Behnken foi utilzado para otimização das varáveis experimentais, as mesmas citadas avaliadas no capítulo II. A metodologia apresentou limites de detecção de 0,330 e 0,0370 µg kg-1, enquanto que os limites de quantificação foram de 1,10 e 0,890 µg kg-1 para cobalto e níquel, 136 respectivamente. A exatidão foi avaliada com aplicação em amostra certificada com recuperação de 97,6% para cobalto e 97,9% para níquel. As metodologias desenvolvidas foram aplicadas com exatidão a diversas amostras de alimentos como: café solúvel, chá verde, chá preto, arroz integral, salsa, cogumelos fungi e shitaki, aveia, amendoim, avelã, amido de milho, farinha de milho e camarão. Dessa forma, é possível afirmar que SAB é técnica de extração em fase líquida ambientalmente segura, além de ser altamente eficiente para pré-concentração de íons metálicos. Este trabalho mostrou a versatilidade destes sistemas confirmando a potencialidade de aplicação desta técnica em metodologias analíticas diversas.