UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde Juliana Janine Figueiredo Ornelas Braz TESTOSTERONA E PRÉ-ECLÂMPSIA: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SOBRE A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO EM ARTERÍOLAS PLACENTÁRIAS Teófilo Otoni-MG 2025 Juliana Janine Figueiredo Ornelas Braz TESTOSTERONA E PRÉ-ECLÂMPSIA: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SOBRE A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO EM ARTERÍOLAS PLACENTÁRIAS Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri - Campus Mucuri. Orientador: Prof.ª Dr. Patrick Wander Teófilo Otoni-MG 2025 AGRADECIMENTOS A conclusão desta etapa tão significativa em minha vida não seria possível sem o amparo e a inspiração que recebi ao longo da caminhada. Primeiramente, agradeço a Deus, fonte de força e sabedoria, que me sustentou em todos os momentos deste percurso. Ao meu esposo, Gefferson, meu companheiro de vida, expresso meu amor e gratidão por dividir comigo o bem mais precioso: nossa família. Sou imensamente grata por nossa filha, Sarah, e pelos nossos gêmeos Arthur e Miguel. Foi por vocês. Manifesto especial reconhecimento ao meu orientador, Dr. Patrick Wander Endlich, pela orientação, paciência e incentivo, fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho. Aos colegas de laboratório, as estudantes de iniciação científica, Alice, Lara, Maria Clara e Taiza, deixo meu reconhecimento pelo empenho e dedicação, elementos que foram fundamentais para o sucesso deste projeto. Aos amigos conquistados na FAMMUC, em especial a Mariana, pela generosidade e paciência em compartilhar seu conhecimento no laboratório, minha sincera gratidão. Ao professor Robson por abrir as portas do Laboratório de Fisiologia e Hipertensão da UFMG e a Amanda pelos ensinamentos. Ao Prof. Marco Fabricio e a Ramona por todo apoio no desenvolvimento desta pesquisa. A professora Glaucia cedendo o laboratório de Regulação Neurohumoral da Circulação da UFES e a Rayner pela parceria. Estendo meus agradecimentos à FAMMUC, à FAPEMIG, à CAPES e à UFVJM pelo apoio institucional e incentivo à pesquisa. A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para minha formação acadêmica e pessoal, registro minha mais profunda gratidão. RESUMO A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome gestacional complexa, caracterizada por disfunção endotelial, hipertensão e comprometimento da perfusão placentária. Evidências crescentes sugerem que níveis elevados de andrógenos, particularmente a testosterona, podem estar implicados na fisiopatologia dessa condição, possivelmente por meio da modulação negativa da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO), um vasodilatador endotelial fundamental. O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos da exposição aguda à testosterona sobre a formação de NO em artérias placentárias humanas, utilizando amostras obtidas de gestantes normotensas e com PE. A metodologia consistiu na incubação de segmentos arteriais com testosterona (10⁻⁶ M), seguida da análise da formação de NO por técnica histoquímica com diaminofluoresceína-2 diacetato (DAF-2DA). A quantificação foi realizada por microscopia de fluorescência e análise densitométrica. Os resultados demonstraram que a exposição aguda à testosterona não promoveu alterações estatisticamente significativas na produção in situ de NO em arteríolas placentárias, tanto no grupo controle quanto no grupo PE (p > 0,05). Esses achados sugerem que, embora a literatura relacione níveis elevados de testosterona à disfunção endotelial, o impacto direto e imediato da testosterona sobre a produção de NO placentário parece ser limitado nas condições experimentais avaliadas. Fatores como o tempo de exposição, a regulação da eNOS, a presença de cofatores (como BH₄), e o estresse oxidativo podem influenciar a resposta vascular e devem ser considerados em investigações futuras. Apesar das limitações, este estudo fornece contribuições relevantes ao demonstrar a aplicabilidade de uma abordagem experimental inédita na análise da reatividade placentária, contribuindo para o aprofundamento do entendimento dos mecanismos hormonais implicados na fisiopatologia da pré-eclâmpsia. Palavras-chave: pré-eclâmpsia, testosterona, óxido nítrico, artérias placentárias, disfunção endotelial, eNOS. ABSTRACT Preeclampsia (PE) is a multifactorial gestational syndrome characterized by endothelial dysfunction, hypertension, and impaired placental perfusion. Growing evidence suggests that elevated androgen levels, particularly testosterone, may be involved in the pathophysiology of this condition, potentially through negative modulation of nitric oxide (NO) bioavailability—an essential endothelial-derived vasodilator. This study aimed to investigate the effects of acute testosterone exposure on NO formation in human placental arteries obtained from normotensive and preeclamptic pregnant women. The methodology involved incubating arterial segments with testosterone (10⁻⁶ M), followed by analysis of NO formation using the histochemical probe diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA). Quantification was performed through fluorescence microscopy and densitometric analysis. The results demonstrated that acute testosterone exposure did not significantly alter in situ NO production in placental arterioles from either group (p > 0.05). These findings suggest that, although elevated testosterone levels are associated with endothelial dysfunction in the literature, the direct and immediate impact of testosterone on placental NO synthesis appears limited under the experimental conditions tested. Variables such as exposure duration, eNOS regulation, availability of cofactors (e.g., BH₄), and oxidative stress may influence vascular responsiveness and should be considered in future investigations. Despite its limitations, this study provides relevant contributions by applying an innovative experimental technique to evaluate placental vascular reactivity, enhancing our understanding of the hormonal mechanisms underlying preeclampsia pathophysiology. Keywords: preeclampsia, testosterone, nitric oxide, placental arteries, endothelial dysfunction, eNOS. SUMÁRIO FOLHA DE APROVAÇÃOErro! Indicador não definido. AGRADECIMENTOS4 RESUMO5 ABSTRACT6 LISTAS DE ILUSTRAÇÕESErro! Indicador não definido. LISTA DE TABELASErro! Indicador não definido. 1. INTRODUÇÃO9 2. OBJETIVO GERAL11 2.1. OBJETIVO ESPECÍFICO11 3. REFERENCIAL TEÓRICO12 3.1 PRÉ-ECLÂMPSIA12 3.2 FISIOPATOLOGIA DA PRÉ-ECLÂMPSIA14 3.2.1 Mecanismos Fisiopatológicos14 3.2.3 Implicações Clínicas15 3.3 PRÉ-ECLÂMPSIA E TESTOSTERONA15 3.4 PRÉ-ECLÂMPSIA E ÓXIDO NÍTRICO17 3.6 MECANISMO DE PRODUÇÃO DE NO18 3.7 ISOFORMAS DA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE18 3.8 REGULAÇÃO E DISFUNÇÃO DA eNOS19 3.9 PAPEL DA eNOS NA GESTAÇÃO E NA PRÉ-ECLÂMPSIA20 3.10 A LESÃO ENDOTELIAL NA PRÉ-ECLÂMPSIA20 3.11 O ENDOTÉLIO VASCULAR E A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO NO CON- TEXTO DA PRÉ-ECLÂMPSIA22 4. MATERIAIS E MÉTODO24 4.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO24 4.2 AMOSTRA24 4.3 RECRUTAMENTO24 4.4 ASPECTOS LEGAIS DA PESQUISA25 4.5 AVALIAÇÕES E INSTRUMENTOS25 4.5.1 Obtenção dos modelos vasculares placentários25 4.5.2 Estimulação dos vasos placentários com testosterona27 4.5.3 Avaliação da morfologia dos vasos placentários por meio da técnica histológica de coloração com hematoxilina e eosina.28 4.5.4 Avaliação dos efeitos da testosterona na geração de NO29 4.6 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS30 4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA31 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO32 5.1 A PRÉ-ECLÂMPSIA NÃO ALTERA A FORMAÇÃO IN SITU DE NO EM ARTE- RÍOLAS PLACENTÁRIAS HUMANAS33 5.2 EM ARTERÍOLAS PLACENTÁRIAS HUMANAS DE GESTANTES NORMO- TENSAS E COM PRÉ-ECLÂMPSIA, A FORMAÇÃO in situ DE NO NÃO É ALTE- RADA PELA EXPOSIÇÃO À TESTOSTERONA36 6. CONCLUSÃO41 REFERENCIAS43 ANEXOS50 ANEXO A - ORIENTAÇÕES PARA COLETA PLACENTÁRIA50 ANEXO B - FORMULÁRIO DE PESQUISA53 ANEXO C - PROTOCOLO DE COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA55 9 1. INTRODUÇÃO Os distúrbios hipertensivos da gestação representam as principais causas de mortalidade materna e perinatal no cenário mundial. Conforme definição do American College of Obstetricians and Gynecologists, tais condições incluem hipertensão gestacional, hipertensão crônica, pré-eclâmpsia (PE) e sobreposição entre hipertensão crônica e PE (ACOG, 2019). Estima-se que a PE afete entre 2% e 7% das gestantes mundialmente, sendo no Brasil a principal causa de partos prematuros correspondendo por uma fração significativa das mortes maternas, com uma incidência de 1,5% (Abalos et al., 2013; Ditisheim; Sibai; Tatevian, 2020; Ramos; Sass; Costa, 2017). Segundo dados do Sistema de Informação sobre Mortalidade (SIM/DATASUS), entre 2012 e 2022, aproximadamente 10% das mortes maternas por causas diretas tiveram como origem a PE definida pela Rede Brasileira de Estudos sobre Hipertensão na Gravidez (2023) como uma síndrome multifatorial e multissistêmica, caracterizada por hipertensão arterial associada à proteinúria ou à disfunção de órgãos-alvo, manifestando-se em mulheres previamente normotensas após a vigésima semana de gestação (Guida et al., 2022b). As pesquisas sobre a etiologia da doença indicam uma patogênese complexa, envolvendo fatores genéticos, deficiências nutricionais, falhas na tolerância imunológica materna, placentação inadequada, resposta inflamatória exacerbada e desregulação de fatores angiogênicos. Contudo apesar de diversas investigações sobre a temática, suas causas ainda permanecem indefinidas (Sieveking et al., 2010; Silasi et al., 2010). Nesse contexto, a placenta desempenha papel essencial como órgão endócrino, sintetizando hormônios fundamentais para a manutenção da gravidez e o crescimento fetal. Dentre esses hormônios, destacam-se os estrogênios, a progesterona e os androgênios, cujas concentrações se elevam significativamente na circulação materna. Na PE, evidências sugerem que a gravidade e a progressão da doença se relacionam com a resposta materna a proteínas e fatores derivados de uma placenta disfuncional, embora a relação entre a disfunção hormonal placentária e a etiopatogenia da síndrome ainda careça de elucidação plena (Huppertz, 2008; Maliqueo; Echiburú; Crisosto, 2016). 10 A partir da observação clínica, estudos revelaram que gestantes com PE tendem a apresentar elevação nos níveis de testosterona (T) circulante, tanto livre quanto conjugada (Keya et al., 2019, Lan et al., 2020, Ibrahim et al., 2020). Em uma amostra de 110 gestantes, Keya et al. (2019) identificaram que 74,3% das mulheres com PE apresentaram níveis elevados de T livre, em comparação com apenas 7,5% das gestantes normotensas. Lan et al. (2020), também constataram concentrações significativamente maiores de T no terceiro trimestre em mulheres com PE, em contraste com gestantes saudáveis. Ibrahim et al. (2020) constataram níveis séricos elevados do hormônio em PE leve quanto no grave. No tocante aos efeitos vasculares da T, Smith et al. (2008) demonstraram que esse hormônio induz vasodilatação em artérias pulmonares humanas isoladas, previamente contraídas com U46619, um análogo do tromboxano A2. Em outra abordagem, Rowell et al. (2009) observaram que a T também promove relaxamento vascular em artérias pré-contraídas com cloreto de potássio, embora tal efeito tenha se manifestado de forma mais acentuada em vasos de homens, sobretudo quando expostos a doses supra fisiológicas. O óxido nítrico (NO) é essencial na regulação do tônus vascular e na manutenção da pressão arterial. Produzido pelas células endoteliais, o NO promove relaxamento da musculatura lisa vascular, inibe a agregação plaquetária e dificulta a adesão leucocitária ao endotélio, sendo um mediador essencial na proteção contra processos trombóticos e inflamatórios e importantíssimo para homeostase cardiovascular (Costa et al., 2007). Evidências experimentais demonstram que a T pode interferir diretamente na biodisponibilidade de NO, comprometendo a vasodilatação endotelial e favorecendo o aumento da pressão arterial, além de influenciar a resposta imune por meio da modulação de células Th17 (Barroso et al., 2021). Diante do exposto, torna- se imprescindível compreender os mecanismos pelos quais a T influencia a função vascular na pré-eclâmpsia, especialmente à sua interação com a via do NO. Investigações nessa direção podem aprofundar a compreensão da fisiopatologia da síndrome e identificar possíveis alvos terapêuticos. Assim, o presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da testosterona sobre a produção de óxido nítrico em arteríolas placentárias de gestantes com PE. 11 2. OBJETIVO GERAL - Avaliar os efeitos da testosterona sobre a produção de óxido nítrico em arteríolas placentárias de gestantes com PE. 2.1. OBJETIVO ESPECÍFICO - Comparar a produção de NO em arteríolas placentárias humanas, provenientes de gestantes com PE e normotensas. - Avaliar a produção de NO diante da exposição à testosterona em arteríolas placentárias humanas, provenientes de gestantes com PE e normotensas. 12 3. REFERENCIAL TEÓRICO 3.1 PRÉ-ECLÂMPSIA A pré-eclâmpsia (PE) representa uma das síndromes hipertensivas específicas da gestação mais associadas a desfechos adversos materno-fetais. Sendo que esta doença se caracteriza por pressão arterial sistólica (PAS) ≥ 140 mmHg ou diastólica (PAD) ≥ 90 mmHg, aferidas em duas ocasiões com intervalo mínimo de seis horas, geralmente após a 20ª semana de gestação. Frequentemente, a condição cursa com proteinúria — definida como excreção superior a 300 mg em 24 horas, razão proteína/creatinina ≥ 0,3 g/g, ou resultado de duas cruzes (++) em fitas reagentes. Na ausência de proteinúria, o diagnóstico pode ser estabelecido diante da presença de critérios de gravidade, como trombocitopenia (<100.000/mm³), creatinina >1,1 mg/dL ou duas vezes superior ao valor basal, elevação das transaminases hepáticas (≥ 2x), edema pulmonar, sintomas visuais ou neurológicos, dor epigástrica ou restrição do crescimento fetal, desde que outros diagnósticos tenham sido descartados (ACOG, 2019). A classificação da PE pode variar conforme o momento da manifestação clínica. Quando os sinais surgem antes da 34ª semana gestacional, define-se como PE de início precoce; após essa idade gestacional, como início tardio (Huppertz, 2008). Classificações baseadas na idade gestacional ao parto — pré-termo (antes de 37 semanas), a termo (a partir de 37 semanas) — e no período puerperal, incluindo a PE pós-parto (Beernink et al., 2022).Ainda, a Rede Brasileira de Estudos sobre Hipertensão na Gravidez (2023) propõe uma subdivisão conforme a presença ou não de sinais de gravidade. A magnitude do impacto da PE pode ser observada em dados epidemiológicos alarmantes. Estima-se que no mundo todo, cerca de 4 milhões de mulheres sejam diagnosticadas anualmente com essa condição, resultando em mais de 70 mil mortes maternas e aproximadamente 500 mil óbitos fetais ou neonatais (Burton et al., 2019) Estudo recente reportou frequência de 6,7% de PE entre 52.986 mulheres no Brasil (Guida et al., 2022a). A ausência de tratamento adequado pode levar a complicações graves como eclâmpsia, insuficiência renal aguda, acidente 13 vascular cerebral, edema agudo de pulmão, ruptura hepática e até óbito (Barroso et al., 2021). Entre os recém-nascidos, há maior risco de restrição de crescimento intrauterino, parto prematuro, displasia broncopulmonar e paralisia cerebral, especialmente quando o nascimento ocorre antes do termo (Galvão; Cavalli; Sandrim, 2021; Guida et al., 2022b) Diante dessa complexidade clínica, a PE exige monitoramento rigoroso, independentemente da sua classificação ou do momento de surgimento dos sintomas. A literatura aponta que até 18% das mulheres com PE podem desenvolver a síndrome HELLP e 55% podem evoluir para eclampsia mesmo com a gestação a termo (Lisonkova et al., 2021). Essa gravidade clínica impulsiona a comunidade científica a aprofundar os estudos sobre a fisiopatologia da PE. Há um movimento contínuo no sentido de identificar biomarcadores, compreender mecanismos moleculares e aperfeiçoar estratégias para diagnóstico precoce, prevenção e intervenção terapêutica. Embora os avanços no manejo clínico tenham reduzido a mortalidade ao longo das últimas décadas, a cura definitiva da PE ainda depende da resolução da gestação e da retirada da placenta — a fonte primária dos fatores implicados na fisiopatologia da doença (Barroso et al., 2021; Fernandes et al., 2024; Guida et al., 2022). Durante o desenvolvimento gestacional, o processo de placentação assegura o suporte nutricional ao embrião em crescimento. Esse processo envolve a formação da placenta e a invasão do útero pelas células trofoblásticas fetais. A partir das vilosidades coriônicas de ancoragem, colunas de citotrofoblastos se organizam e os trofoblastos extravilosos penetram a decídua, promovendo a remodelação das artérias espiraladas. Tal remodelação transforma vasos de alta resistência e baixo fluxo em estruturas de diâmetro dilatado, garantindo uma perfusão eficaz ao espaço interviloso. Durante esse processo, ocorre perda da musculatura lisa e da lâmina elástica, além da deposição de matriz fibrinoide nas paredes vasculares (Burton et al., 2009; PIJNENBORG et al., 1981). Após a degeneração do endotélio vascular, os trofoblastos endovasculares assumem papel ativo na modulação da camada média, composta por músculo liso. As células endoteliais, por sua vez, regulam a diferenciação e proliferação das células musculares lisas e modulam a deposição de matriz extracelular, ações estas mediadas principalmente pela liberação de óxido nítrico (NO) (Harris; Aplin, 2007; Powell et al., 1997). 14 Brosens et al. (1967) foram os primeiros a associar a PE ao comprometimento da modificação fisiológica das artérias espiraladas. Eles descreveram vasos persistentemente estreitos e com paredes espessas, preservando as camadas musculares e elásticas, o que compromete a perfusão uteroplacentária. Atualmente, compreende-se que a PE evolui em duas fases distintas. A primeira ocorre nas primeiras 12 semanas de gestação e envolve a falha na invasão trofoblástica e na remodelação arterial. Como consequência, o sangue materno penetra bruscamente o espaço interviloso, gerando dano mecânico aos sinciciotrofoblastos. A segunda fase, que ocorre no segundo ou terceiro trimestre, resulta da hipoperfusão crônica e da isquemia placentária, que induzem a liberação de citocinas inflamatórias e espécies reativas de oxigênio (EROs), culminando em disfunção endotelial sistêmica e manifestações clínicas da PE (Roberts; Hubel, 2009; Silasi et al., 2010). Vale destacar que esse aumento nas EROs coincide com o terceiro trimestre, período em que os níveis de testosterona também se elevam nas gestantes com PE. A esteroidogênese, via mitocôndrias e enzimas do citocromo P450, naturalmente produzem EROs (Hanukoglu, 2006). Contudo, na PE, o estresse oxidativo se intensifica, exacerbando a produção dessas espécies (Takagi et al., 2004) Além disso, sabe-se que as EROs alteram a resistência e o fluxo sanguíneo fetoplacentário, e sua presença contínua pode comprometer o crescimento fetal ao elevar a resistência vascular placentária (Mills et al., 2009). 3.2 FISIOPATOLOGIA DA PRÉ-ECLÂMPSIA 3.2.1 Mecanismos Fisiopatológicos O desenvolvimento da PE resulta da interação de múltiplos processos fisiopatológicos: Em condições normais, o trofoblasto invade de maneira profunda as artérias espiraladas uterinas, promovendo a conversão desses vasos em canais de baixa resistência e alto fluxo sanguíneo. No entanto, na pré-eclâmpsia, essa invasão é superficial, resultando em hipoperfusão placentária e hipóxia (Steegers et al., 2010). A hipóxia placentária leva à secreção aumentada de fatores antiangiogênicos, como o receptor solúvel fms-like tirosina quinase-1 (sFlt-1), o qual 15 sequestra fatores pró-angiogênicos, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento placentário (PlGF), inibindo a formação adequada de vasos sanguineos (Ikeda et al., 2009; Matsubara et al., 2015). Concomitantemente, estabelece-se disfunção endotelial sistêmica, marcada pela redução da biodisponibilidade de NO e pelo aumento de EROs, resultando em vasoconstrição, aumento da permeabilidade vascular e ativação do sistema de coagulação (Titov et al., 2024). Além disso, observa-se resposta inflamatória sistêmica exacerbada, caracterizada pela ativação de células imunológicas maternas, que agrava a disfunção vascular e contribui para lesões de órgãos-alvo, como rins, fígado e cérebro (Ikeda et al., 2009; Matsubara et al., 2015). 3.2.3 Implicações Clínicas Os principais sinais clínicos da pré-eclâmpsia incluem hipertensão arterial ≥140/90 mmHg, proteinúria ≥300 mg/24h e edema generalizado. Em formas graves, podem ocorrer sintomas neurológicos, como cefaleia intensa e alterações visuais, além de disfunções hepáticas, renais e hematológicas (Burton et al., 2019). 3.3 PRÉ-ECLÂMPSIA E TESTOSTERONA Na PE os níveis elevados de testosterona observados na circulação materna parecem ter origem predominantemente placentária. Durante a segunda metade da gestação, tanto o feto quanto a mãe intensificam a produção de sulfato de desidroepiandrosterona (DHEA-S), um precursor androgênico captado pela placenta por meio de transportadores específicos como o OAT-4, OATP2B1 e o transportador dependente de sódio SOAT. Após a captação, o DHEA-S é dessulfatado e, por ação de enzimas esteroidogênicas placentárias, convertido em androstenediona e, subsequentemente, em testosterona (Mason et al., 1993). Na PE, há uma diminuição significativa na expressão do RNA mensageiro (RNAm) da aromatase, também conhecida como CYP19A1, assim como nos níveis dessa enzima na placenta, comprometendo a conversão de andrógenos em estrogênios e resultando no acúmulo de testosterona (Perez-Sepulveda et al., 2015). Esse desequilíbrio enzimático interfere na regulação vascular, promovendo alterações 16 na hemodinâmica uterina, evidenciadas pela redução do diâmetro das artérias uterinas e pelo aumento do índice de pulsatilidade, o que reflete uma maior resistência ao fluxo sanguíneo (Gopalakrishnan et al., 2016). Estudos também mostram que a testosterona exerce impacto negativo sobre a oxigenação placentária, ao aumentar a resistência das artérias espiraladas e ao modular a expressão de fatores angiogênicos, incluindo a redução da liberação do VEGF pela placenta onde os níveis de testosterona em gestantes com PE encontram- se aproximadamente duas a três vezes mais elevados em comparação com gestantes normotensas, correlacionando-se positivamente com a disfunção vascular (Kumar et al., 2018; Maliqueo; Echiburú; Crisosto, 2016; Mishra; Kumar, 2021). Adicionalmente, Hsu et al., (2009) detectaram aumento da testosterona sérica, elevação da expressão de RNAm dos receptores de androgênio e presença marcante desses receptores nos sinciciotrofoblastos e nas células do estroma placentário em mulheres com PE. Lan et al.,(2020), por sua vez, também encontraram altos níveis séricos de testosterona e dos níveis dos receptores de androgênio nos sinciciotrofoblastos, embora sem alteração no RNAm desses receptores, sugerindo que mecanismos pós-transcricionais ou epigenéticos ainda não totalmente elucidados podem levar a esses desfechos na placenta. Além do papel na gestação, a testosterona tem sido amplamente estudada por seus efeitos vasculares, particularmente em contextos clínicos como a síndrome dos ovários policísticos (SOP), em que a hiperandrogenemia se associa a maior risco de eventos cardiovasculares, incluindo infarto do miocárdio, hipertensão arterial e doença coronariana (Kalin; Zumoff, 1990; Mattsson et al., 1984; Soranno et al., 1999; Talbott et al., 1995). Malkin et al., (2006) observaram em homens com deficiência androgênica que o tratamento com testosterona por três meses aumentou a resposta vasoconstritora à noradrenalina e reduziu a vasodilatação induzida por acetilcolina (ACh) e nitroprussiato de sódio em artérias de resistência subcutânea, indicando uma modulação da reatividade vascular por esse hormônio. Do ponto de vista molecular, os efeitos vasculares da testosterona podem ocorrer tanto por vias genômicas quanto não genômicas. As respostas agudas, geralmente independentes dos receptores androgênicos, parecem envolver mecanismos não genômicos, enquanto as alterações de longo prazo, associadas à ativação dos receptores nucleares, permanecem controversas quanto à sua influência sobre a função endotelial e a reatividade vascular (Jones et al., 2003). 17 O NO destaca-se como mediador essencial na regulação do fluxo sanguíneo placentário (BUTTERY et al., 1994). Em estudos com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs), observou-se que tanto a testosterona quanto a di-hidrotestosterona aumentaram os níveis da isoforma do óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), sendo este efeito significativamente atenuado pela inibição dos receptores androgênicos (Goglia et al., 2010). Adicionalmente, quando as HUVECs foram submetidas à senescência induzida por peróxido de hidrogênio, o tratamento com testosterona e di-hidrotestosterona elevou os níveis totais e fosforilados de eNOS, sugerindo um papel protetor ou adaptativo sob condições de estresse oxidativo (Ota et al., 2012). 3.4 PRÉ-ECLÂMPSIA E ÓXIDO NÍTRICO O NO exerce papel essencial na manutenção do tônus vascular durante a gestação, promovendo vasodilatação e assegurando um fluxo sanguíneo adequado entre a mãe e o feto. Nos vasos sanguíneos, esse gás sinalizador é sintetizado a partir da L-arginina, por meio da ação da eNOS, sendo fundamental para o relaxamento do músculo liso vascular, inibição da agregação plaquetária e redução da adesão de leucócitos ao endotélio (BUTTERY et al., 1994). Na PE há evidências de uma redução na biodisponibilidade de NO, sendo que essa deficiência está diretamente associada à disfunção endotelial e à elevação da resistência vascular sistêmica, fatores centrais na fisiopatologia dessa doença (Roberts; Hubel, 2009). Estudos apontam que os níveis circulantes de nitrito e nitrato — metabólitos estáveis do NO — encontram-se diminuídos em mulheres com PE, indicando uma síntese reduzida de NO. A disfunção na via do NO pode ainda ser agravada pela presença de inibidores endógenos, como a dimetilarginina assimétrica (ADMA), cuja elevação já foi documentada em gestantes com PE (Baksu; Gürarslan; Göker, 2004; Mills et al., 2009) A suplementação com L-arginina — substrato da eNOS — tem sido investigada como estratégia terapêutica para prevenir a pré-eclâmpsia, sobretudo em gestantes de alto risco. Um ensaio clínico randomizado demonstrou que a administração de L-arginina, isoladamente ou em combinação com antioxidantes, reduziu significativamente a incidência de PE em comparação ao placebo. Esses 18 achados sugerem que intervenções que restauram a via do NO podem contribuir para o restabelecimento da função endotelial e redução de complicações gestacionais (Goglia et al., 2010; Ota et al., 2012). Por outro lado, estudo mostrou que os níveis séricos de NO não diferiram significativamente entre gestantes que desenvolveram complicações hipertensivas e aquelas com evolução normal da gravidez, indicando que a regulação do NO pode ser modulada por diversos fatores, incluindo o estágio da gestação, variabilidade genética e influência de outras vias moleculares associadas ao estresse oxidativo e à inflamação (Choi; Im; Pai, 2002a; I et al., 2020; Kaihara et al., 2023; Roussis et al., 2004) Dessa forma, embora a redução da geração NO represente um dos mecanismos centrais da disfunção endotelial na PE, a complexa fisiopatologia dessa doença sugere que múltiplos sistemas — como os eixos hormonal, imunológico e redox — interagem com a via do NO para o desfecho da doença (Torres-Torres et al., 2024) 3.6 MECANISMO DE PRODUÇÃO DE NO A biossíntese do NO ocorre a partir da conversão enzimática da L-arginina em L-citrulina e NO, catalisada pelo óxido nítrico sintase (NOS), utilizando o oxigênio molecular (O₂) e a NADPH. Essa reação é dependente de diversos cofatores, incluindo a tetrahidrobiopterina (BH₄), flavina mononucleotídeo (FMN), flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e calmodulina (CaM). A funcionalidade da enzima NOS requer sua forma dimérica, a qual facilita a transferência de elétrons do domínio redutase (ligado ao NADPH) para o domínio oxigenase, onde o NO é efetivamente gerado (Khaing et al., 2022), 3.7 ISOFORMAS DA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE A enzima NOS apresenta três isoformas que diferem em localização tecidual, mecanismos regulatórios e função fisiológica: • NOS endotelial (eNOS ou NOS3): expressada principalmente nas células endoteliais vasculares, a eNOS é fundamental para a vasodilatação dependente do endotélio, promovendo relaxamento do músculo liso por meio da ativação da via da guanilato ciclase solúvel (GCs) e subsequente produção de GMP 19 cíclico (GMPc). A eNOS também pode ser expressada em plaquetas, epitélio renal, cardiomiócitos e na placenta, sendo regulada por estímulos mecânicos, como o estresse de cisalhamento, e por vias intracelulares como PI3K/Akt (Fosfatidilinositol 3-Quinase) que promovem sua fosforilação em resíduo de serina1177, aumentando a produção de NO (Keya et al., 2019; Khaing et al., 2022) • NOS neuronal (nNOS ou NOS1): presente predominantemente em neurônios, essa isoforma está envolvida na neurotransmissão, plasticidade sináptica, modulação da pressão arterial e contratilidade cardíaca. No miocárdio, sua atuação no retículo sarcoplasmático influencia a liberação de cálcio intracelular e, consequentemente, a força de contração cardíaca. A ativação da nNOS também depende de cálcio e calmodulina, e sua sinalização ocorre, em parte, por meio da ativação de canais iônicos e proteínas quinases dependentes de GMPc (Keya et al., 2019; Khaing et al., 2022). • NOS induzível (iNOS ou NOS2): ao contrário das isoformas constitutivas, a iNOS é expressada em células do sistema imune — como macrófagos e neutrófilos — em resposta a estímulos inflamatórios intensos, como citocinas (TNF-α, IL-1β) e lipopolissacarídeos bacterianos (LPS). Uma vez ativada, a iNOS produz grandes quantidades de NO de maneira contínua e independente de cálcio. Embora tenha ação antimicrobiana e citotóxica contra patógenos, a produção descontrolada de NO por essa via pode gerar dano tecidual, por meio da formação de espécies reativas como o peroxinitrito (ONOO⁻), resultante da combinação do NO com o ânion superóxido (O₂⁻) (Sandrim et al., 2020). 3.8 REGULAÇÃO E DISFUNÇÃO DA eNOS A regulação da atividade da NOS ocorre principalmente por fosforilação e associação com proteínas reguladoras. Particularmente, a eNOS é ativada por fosforilação em Ser1177 via PI3K/Akt e inibida pela fosforilação em Thr495. Além disso, a disponibilidade dos cofatores — especialmente BH₄ — é crítica para o funcionamento adequado da enzima. A deficiência de BH₄ ou de L-arginina pode causar o desacoplamento da NOS, levando à produção de ânion superóxido em vez de NO, exacerbando o estresse oxidativo e promovendo danos celulares (Goglia et al., 2010; Ota et al., 2012) 20 Esse processo está amplamente envolvido com a disfunção endotelial, condição associada a doenças como hipertensão arterial, diabetes, aterosclerose e PE. A menor biodisponibilidade de NO pode decorrer da redução na expressão da eNOS, do aumento da interação do NO com EROs, ou ainda da ação de inibidores endógenos como a ADMA e a NG-monometil-L-arginina (L-NMMA), que competem com a L-arginina pelo sítio catalítico da NOS, reduzindo sua eficiência (Hanukoglu, 2006; Malkin et al., 2006). 3.9 PAPEL DA eNOS NA GESTAÇÃO E NA PRÉ-ECLÂMPSIA Durante a gestação, a atividade da eNOS na placenta e nas artérias uterinas é fundamental para o aumento do fluxo sanguíneo uteroplacentário. Em condições normais, o NO participa da remodelação vascular e contribui para a diminuição da resistência das artérias espiraladas. Na PE, a expressão de eNOS está reduzida e o sistema antioxidante comprometido, levando à diminuição na produção de NO e ao aumento de EROs (Herur et al., 2022; Khaing et al., 2022) Esse desequilíbrio agrava o quadro de vasoconstrição, inflamação sistêmica e lesão endotelial, características marcantes da fisiopatologia da doença. Portanto, estratégias terapêuticas que restauram a produção de NO — como suplementação de L-arginina ou BH₄, ou uso de antioxidantes — vêm sendo exploradas com o objetivo de prevenir ou atenuar os efeitos da disfunção endotelial na gestação (Herur et al., 2022) 3.10 A LESÃO ENDOTELIAL NA PRÉ-ECLÂMPSIA A hipótese da placentação secundária insuficiente fornece uma explicação fisiopatológica para o desencadeamento da lesão endotelial observada na PE. Em condições gestacionais normais, a adequada invasão das artérias espiraladas por citotrofoblastos fetais resulta em sua remodelação estrutural, com perda da camada muscular e dilatação luminal, permitindo o aumento do fluxo sanguíneo uteroplacentário e a redução da resistência vascular. Contudo, na PE, esse processo encontra-se prejudicado, levando à placentação deficiente, hipoperfusão e hipóxia placentária, eventos que culminam na liberação de mediadores tóxicos à circulação 21 materna e promovem disfunção endotelial sistêmica (Laura Hernández Carratalá, 2022; PIJNENBORG et al., 1981) . A falha no remodelamento das artérias espiraladas promove um ambiente placentário hipóxico e oxidativo, estimulando a produção de fatores antiangiogênicos, entre os quais destacam-se o receptor tirosina quinase solúvel Fms-like (sFlt-1) e a endoglina solúvel (sEng). O sFlt-1 atua como um receptor solúvel para os fatores pró- angiogênicos VEGF (vascular endothelial growth factor) e PlGF (placental growth factor), impedindo sua ação sobre os receptores endoteliais e contribuindo para a lesão endotelial e vasoconstrição sistêmica (Fernandes et al., 2024; Guida et al., 2022). A elevação de sFlt-1 no plasma materno, observada em estágios precoces da gestação em mulheres que desenvolverão PE, acompanha-se de uma redução dos níveis circulantes de PlGF e VEGF, indicando um desequilíbrio entre fatores angiogênicos e antiangiogênicos. Essa alteração precede o início dos sintomas clínicos, e a razão sFlt-1/PlGF tem se mostrado um biomarcador promissor para a predição e diagnóstico precoce da PE (Sieveking et al., 2010; Silasi et al., 2010) De forma similar, o sEng, um correceptor de TGF-β1 e TGF-β3, atua suprimindo a sinalização endotelial mediada por essas citocinas. Estudos demonstram que seus níveis também se encontram elevados na PE e se correlacionam com a gravidade da doença. Curiosamente, ao contrário do sFlt-1, o sEng pode aumentar mesmo na ausência de hipóxia placentária, sugerindo mecanismos distintos para sua indução. Além da via angiogênica, a desregulação do sistema renina-angiotensina (SRA) também participa na gênese da disfunção endotelial na PE. A ativação exacerbada de receptores AT1 por autoanticorpos agonistas leva à vasoconstrição e aumento da expressão de sFlt-1 e sEng, em um mecanismo que agrava o estado antiangiogênico e hipertensivo da doença (Chinnathambi et al., 2014a, 2014b; Mishra; Kumar, 2021) Esse ambiente desfavorável resulta em comprometimento da atividade da eNOS, com consequente redução da produção de NO. A deficiência de NO promove vasoconstrição, aumento da adesividade leucocitária, ativação plaquetária e formação de trombos, agravando o quadro de lesão endotelial sistêmica. Dessa forma, o processo iniciado na interface placentária ultrapassa suas fronteiras e afeta diversos sistemas orgânicos maternos, justificando as manifestações multissistêmicas da PE (BUTTERY et al., 1994; Liao et al., 1996) 22 Notavelmente, estudos demonstram que mesmo gestantes com proteinúria isolada, sem elevação da pressão arterial, podem apresentar níveis aumentados de sFlt-1 e marcadores de lesão endotelial. Essa observação reforça a noção de que a proteinúria pode representar uma forma inicial ou atenuada da PE, e não apenas um sintoma isolado (BUTTERY et al., 1994; Herur et al., 2022; Liao et al., 1996; Sandrim et al., 2020) 3.11 O ENDOTÉLIO VASCULAR E A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO NO CONTEXTO DA PRÉ-ECLÂMPSIA O endotélio vascular, composto por uma única camada de células que reveste internamente os vasos sanguíneos, desempenha funções essenciais na manutenção da homeostase cardiovascular. Além de regular o tônus vascular e controlar o transporte de nutrientes e células inflamatórias, o endotélio modula a hemostasia, a resposta inflamatória, o crescimento celular e o equilíbrio entre vasoconstrição e vasodilatação (Brandão AHF; Cabral ACV; Cabral MA, 2011) Entre os mediadores vasodilatadores produzidos pelo endotélio, o NO destaca-se por sua atuação crítica na regulação da resistência vascular sistêmica e na prevenção de eventos trombóticos. O NO é sintetizado a partir da L-arginina pela ação da eNOS, enzima cuja atividade é modulada por estímulos físicos, como o estresse de cisalhamento, e por estímulos químicos, como bradicinina, acetilcolina e angiotensina-(1-7) (Goglia et al., 2010; Ota et al., 2012). A regulação da eNOS envolve tanto modulação transcricional quanto pós- transducional, com destaque para a fosforilação da eNOS na Ser1177, que promove sua ativação, e para a sua associação com cofatores como BH₄ e calmodulina. Em situações de hipóxia ou hipoperfusão, o endotélio funcional responde com aumento compensatório na produção de NO, resultando em vasodilatação local e melhora da perfusão tecidual. Contudo, a meia-vida curta do NO, que não ultrapassa alguns segundos devido à sua rápida degradação pela hemoglobina e reatividade com espécies oxidantes, dificulta sua quantificação direta na circulação. Por essa razão, sua atividade é frequentemente estimada por meio da dosagem indireta de nitrito e nitrato plasmáticos, metabólitos estáveis derivados do NO, ou ainda por técnicas funcionais, como a dilatação fluxo-mediada (FMD) da artéria braquial — um método 23 não invasivo amplamente utilizado na avaliação da função endotelial dependente de NO (Goglia et al., 2010; Ota et al., 2012). Além dos fatores mecânicos, os esteroides sexuais também exercem forte influência sobre a atividade endotelial. Os receptores de estrogênio (ERα e ERβ) presentes nas células endoteliais promovem a ativação da eNOS, tanto por vias genômicas quanto não genômicas. A flutuação dos níveis de estrogênio ao longo do ciclo menstrual afeta diretamente a biodisponibilidade de NO, e a terapia de reposição hormonal (TRH) demonstrou potencial para restaurar a função endotelial em mulheres pós-menopáusicas, por meio da estimulação da via NO-eNOS (Barroso et al., 2021; Mills et al., 2009). A participação do SRA na regulação do NO também é bem estabelecida. A angiotensina II (Ang II), por meio da ativação do receptor AT1, promove vasoconstrição, estresse oxidativo e inibição da produção de NO, contribuindo para disfunção endotelial. Por outro lado, a angiotensina-(1-7) ao atuar sobre o receptor estimula a síntese de NO e favorece a vasodilatação, demonstrando um papel protetor contra o dano vascular (Sieveking et al., 2010; Silasi et al., 2010). No contexto da PE, autoanticorpos agonistas dos receptores AT1 (AT1-AA) surgem como um componente chave na fisiopatologia da doença. Esses autoanticorpos mimetizam a ação da Ang II, ativando cronicamente os receptores AT1, o que acarreta aumento da produção de fatores antiangiogênicos (como sFlt-1), aumento do estresse oxidativo e redução da atividade da eNOS, promovendo disfunção endotelial sistêmica. A ativação contínua da via AT1 também impede o equilíbrio entre os sistemas pró e antiangiogênicos, afetando a perfusão placentária e exacerbando a hipertensão gestacional. Portanto, o endotélio vascular não apenas representa um alvo primário na fisiopatologia da PE, como também desempenha um papel central na transição de uma placentação deficiente para uma síndrome sistêmica multiorgânica, por meio do comprometimento da síntese e ação do NO (Ikeda et al., 2009; Mishra & Kumar, 2021; Sieveking et al., 2010). 24 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO Trata-se de um estudo observacional analítico de natureza translacional, com abordagem quantitativa e procedimento experimental, que estudou mecanismos fisiopatológicos em vasos sanguíneos ex vivo, no qual gestantes ao chegar na maternidade de referência, sediada no município de Teófilo Otoni-MG, após a realização das avaliações do plantonista e internadas para realização do parto, foram convidadas a colaborar com o estudo por meio de permissão para uso de arteríolas placentárias (consideradas resíduo biológico) em experimentos científicos. 4.2 AMOSTRA Para o cálculo amostral foi realizado um estudo de Hsu et al., (2009), sendo o N determinado com base na variável expressão dos receptores androgênicos, visto que essa apresentou maior dispersão. Considerando o tamanho do efeito de 33,1 alfa=0,05 e o poder do teste 0,80, pelo teste T para amostras independentes o cálculo estimado foi de 14 gestantes por grupo, totalizando 28 participantes. 4.3 RECRUTAMENTO O recrutamento foi realizado de forma aleatória, por meio de convite verbal, durante os meses de fevereiro a abril de 2024. As voluntárias foram divididas em dois grupos, sendo: gestantes normotensas (NT) e gestantes com pré-eclâmpsia (PE); que deveriam obedecer aos seguintes critérios de inclusão: idade igual ou superior a 18 anos e no mínimo 20 semanas de gestação. Para delimitação do grupo PE, as voluntárias atenderam aos seguintes critérios de inclusão: pressão arterial sistólica (PAS) ≥140 mmHg ou pressão arterial diastólica (PAD) ≥ 90mmHg e com proteinúria (razão proteinúria/creatinina urinária de 0,3 g/g de creatinina). Quanto ao grupo NT, atenderam aos seguintes critérios: pressão arterial sistólica (PAS) ≤ 120 mmHg e pressão arterial diastólica (PAD) ≤ 80mmHg [número de medidas: 3 medidas com intervalo de 1 a 2 minutos e obedecendo todas instruções para medida da pressão arterial previstas nas Diretrizes Brasileiras de Hipertensão Arterial (Barroso et al., 25 2021). Foram excluídas do estudo gestantes com diabetes mellitus, hipertensão crônica com pré-eclâmpsia sobreposta, insuficiência renal, presença de doenças autoimunes, disfunção endócrina prévia, obesas, tabagistas, etilistas e aquelas que se negaram a assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). 4.4 ASPECTOS LEGAIS DA PESQUISA Todos os procedimentos da pesquisa respeitaram as recomendações do Conselho Nacional de Saúde, por meio da Resolução 466/12 (BRASIL, 2012), a qual apresenta normas regulamentadoras de pesquisa envolvendo seres humanos. O estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFVJM (parecer 6.565.977). 4.5 AVALIAÇÕES E INSTRUMENTOS Logo após o recrutamento e inclusão no estudo, foi realizada a distribuição das voluntárias de acordo com o grupo específico com base nos registros clínicos da gestante. A verificação do tipo de vaso placentário foi realizada por meio de técnica histológica. Os efeitos tanto da PE, quanto testosterona sobre a produção de NO foi mensurado por meio de ensaio de fluorescência utilizando a sonda 4,5- diaminofluoresceína (DAF-2). 4.5.1 Obtenção dos modelos vasculares placentários O isolamento das artérias placentárias ancoradas na face maternal da placenta foi realizado conforme adaptação da técnica descrita por Wareing et al. (2002). Após o parto, as placentas foram diretamente colocadas em uma solução de Krebs modificada gelada (em mmol * L-1 ; 127,76 NaCl; 25 NaHCO3; 4,69 KCl; 2,4 MgSO4; 1,6 CaCl2; 1,18 KH2PO4; 6,05 glicose; 0,034 EDTA; pH 7,4), acondicionadas em caixa térmica com temperatura entre 2º a 8ºC e imediatamente encaminhadas ao Laboratório de Estudos de Processos Vitais da Faculdade de Medicina do Mucuri da UFVJM, onde foram isolados os vasos (dissecados do tecido conjuntivo circundante) com uso de lupa com iluminação, conforme protocolo descrito a seguir: Na FIG:1A, apresenta a face fetal placentária, já a face materna, denominada de placa basal (FIG. 26 1B), é caracterizada pela presença da decídua, uma camada do endométrio modificado para a gestação e também por possuir regiões ligeiramente elevadas denominadas de lobos ou cotilédones, em número de 10 a 40 em placentas a termo, que são separadas por fendas descritas como septos placentários (Myren et al., 2007). Sendo assim, por se tratar de um espaço virtual, sem delimitações anatômicas precisas, ao localizar os vasos sanguíneos que se encontravam ancorados na placa basal foi realizado um corte transversal na placenta, com o objetivo de separar a decídua da placa coriônica, partes materna e fetal, sendo essa última desprezada e aquela utilizada para as demais etapas do experimento. Retornando a região dos cotilédones, com auxílio de pinças delicadas foram realizadas a dissecação dos vasos placentários que se encontravam ancorados na decídua (FIG. 2). Figura 1 – Placenta face fetal (A), placa basal/decídua (B) Fonte: Elaborado pela autora (2025). Figura 2 – Dissecção dos vasos placentários humanos. Após início da dissecção a partir dos cotilédones e visualização do vaso ancorado na placa basal, com auxílio de lupa com iluminação, inicia-se a dissecção do vaso 27 Fonte: Elaborado pela autora (2025). Os vasos sanguíneos isolados da decídua foram imediatamente transferidos para uma placa de Petri contendo solução de Krebs gelada, na qual eram cortados em segmentos de 5 mm, sendo que uma parte desses vasos foram imersos em formalina 10% e estocados para as análises histológicas, e o restante utilizado para a estimulação com testosterona, e posteriormente estocados a -80ºC para realização dos experimentos. 4.5.2 Estimulação dos vasos placentários com testosterona Parte dos vasos isolados foram imediatamente imersos em TissueTek Optimun Cutting Temperature (O.C.T.) (Sakura Finetek Inc., EUA), e posteriormente congelados à -80ºC. Ainda, outra parte foi imersa em solução de Krebs gaseificada com 5% de CO2 e 95% de O2, pH de 7,4, à 37ºC e, por conseguinte, incubados com testosterona (T) (Gemini indústria de insumos farmacêuticos LTDA) 10−6 M por 10 minutos. Nós não encontramos na literatura disponível, dados relativos à concentração de testosterona com efeito vasoativo em vasos sanguíneos de mulheres com síndrome hipertensiva gestacional. Portanto, foi escolhida uma concentração de testosterona utilizada em estudos experimentais com efeito vasoativo (ALVES et al., 2020). 28 Logo após essa estimulação, esses vasos estimulados também foram imersos em TissueTek Optimun Cutting Temperature (O.C.T.) (Sakura Finetek Inc., EUA) e congelados à -80ºC, ficando sob essas condições até o dia dos ensaios de fluorescência. 4.5.3 Avaliação da morfologia dos vasos placentários por meio da técnica histológica de coloração com hematoxilina e eosina. A dissecção dos vasos placentários das gestantes não permitiu identificação do tipo, ou seja, diferenciar entre arteríolas ou vênulas. Sendo assim, a análise histológica nos permitiu identificar o tipo de vaso para que pudéssemos prosseguir apenas com as arteríolas placentárias humana nos demais experimentos. Os vasos placentários retirados para histologia, foram fixados em formalina tamponada (PBS 10%). Após 24 horas nessa solução foi realizado a troca para álcool 70% até a realização do processo de desidratação da peça e preparo das lâminas para análise dos tecidos. O processo de inclusão em parafina com banhos de álcool foi realizado, conforme o protocolo do Laboratório de Histologia da Fammuc/UFVJM. No dia seguinte foi realizado banhos de xilol a 100% e de parafina para a confecção dos blocos e preparação para os cortes. Após 48 horas da formação dos blocos e certificado que esses já estavam endurecidos, foram realizados cortes de 5 µm e preparo das lâminas. Após 24 horas, as lâminas foram coradas com Hematoxilina & Eosina (HE), seguindo o protocolo do Laboratório de Microscopia da Fammuc/UFVJM. Em seguida as lâminas foram analisadas e os vasos placentários foram avaliados em sua morfologia de acordo com a descrição de Taylor e Bordoni (2023), na qual caracterizam as artérias de médio e pequeno calibre em cortes histológicos como túnica média formada principalmente por células musculares lisas, com pouca ou nenhuma lâmina elástica; sua túnica íntima apresentando uma camada subendotelial menos espessa do que a das artérias elásticas; túnica média podendo conter até 40 camadas de células musculares lisas nos vasos mais calibrosos, sendo essas células entremeadas por algumas lâminas elásticas (nos vasos maiores), como também por fibras reticulares e proteoglicanos e a túnica adventícia composta por tecido conjuntivo denso e frouxo. Dessa forma, sendo mantido nos experimentos os vasos placentários que apresentassem essas características histológicas arteriais, 29 conforme análise descrita acima e, sendo excluídos da amostra os vasos que não foram visualizados morfologicamente como artérias placentárias. Figura 3 – Lâminas histológicas das arteríolas placentárias humanas. Imagem do corte histológico de uma arteríola placentária de gestante pertencente ao grupo normotenso (A) e pré-eclâmpsia (B). Fonte: Elaborado pela autora (2025). 4.5.4 Avaliação dos efeitos da testosterona na geração de NO A detecção de NO foi determinada por meio de fluorescência usando a sonda diacetato 4,5-diaminofluorofluoresceína (DAF-2). Os segmentos arteriais da placenta foram mantidos por 1 hora em solução Krebs-Henseleit com 30% de sacarose e, em seguida, congeladas em meio adequado (composto Tissue-Plus OCT). Por conseguinte, as amostras foram cortadas em anéis de 10µm de espessura usando um criostato e as lâminas contendo as fatias foram lavadas e subsequentemente incubadas em solução Krebs-Henseleit por 30 minutos em uma câmara úmida a 37ºC. Para a detecção do NO, as arteríolas foram incubadas com DAF-2 diluído em tampão fosfato (0,1 M) contendo CaCl2 (0,45 M) em uma estufa com câmara fechada a 37 ºC. Na presença do NO, o DAF-2 não-fluorescente é convertido em seu derivado fluorescente triazole (Räthel et al., 2003). A intensidade da fluorescência foi detectada e quantificada nas secções de tecido usando um microscópio de fluorescência (Leica DM 2500 TI, Wetzlar, Alemanha) e câmera 30 fotográfica (NIKON digital sigth DS-U2, Tóquio, Japão). As lâminas foram preparadas no laboratório de histologia molecular e imunohistoquímica (LHMI) da Universidade Federal do Espírito Santo e as imagens foram analisadas por meio do programa ImageJ (National Institutes of Health, EUA). Foram captadas 4 imagens de cada lâmina, adotando-se como resultado a média dessas imagens. Todos os resultados foram calculados usando a média da intensidade da fluorescência de pixel subtraída pelo background. 4.6 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS As gestantes que chegavam para o trabalho de parto ou com queixas relativas à gestação, foram escolhidas aleatoriamente para adesão ao estudo. As gestantes que se enquadraram nos critérios de inclusão para o grupo NT, quanto PE, foram convidadas a participar da pesquisa. Primeiramente, essas mulheres receberam informações relativas aos objetivos da pesquisa, seus riscos e benefícios, assim como, garantia de sigilo das informações, identificação dos membros da equipe e suas respectivas instituições. Ademais, quando solicitados, foram prestados quaisquer outros esclarecimentos que se fizeram necessários pelos pesquisadores. Por conseguinte, foi realizada a leitura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e em caso de consentimento à colaboração com o estudo, foram solicitadas a proceder com a assinatura desse documento, em observância ao disposto na Resolução n° 466/12 do Conselho Nacional de Saúde. As informações obtidas foram confidenciais, assegurando o sigilo sobre a participação, tendo as voluntárias o direito de interromper sua colaboração em qualquer etapa do estudo. Após o recrutamento, o pesquisador acessou as informações do cartão da gestante para anotar os dados de identificação, endereço, contato, raça, idade, idade gestacional (IG), índice de massa corporal gestacional, data provável do parto, presença de comorbidades, medicamentos em uso, doenças agudas, nuliparidade ou multiparidade, IG do diagnóstico de PE e os dados necessários para classificar as gestantes como normotensas e hipertensas, à saber: pressão arterial mensurada e proteinúria. No momento do parto, obteve-se informações relativas à idade gestacional, peso, índice de massa corpórea gestacional, peso do neonato e pressão arterial. Todas essas informações foram anotadas em formulário próprio (ANEXO). No ato do parto das voluntárias, os pesquisadores envolvidos se dirigiram à maternidade 31 e após a dequitação da placenta, esta foi imersa em solução de Krebs e armazenada em caixa térmica e transportada até o Laboratório de Estudos de Processos Vitais da Faculdade de Medicina da UFVJM visando isolamento dos vasos, estimulação com testosterona, armazenamento à -80ºC ou em álcool, até o dia dos experimentos de histologia e fluorescência. 4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA Foi realizado o teste Shapiro-Wilk para análise da normalidade dos dados e os mesmos são apresentados como médiaerro padrão da média. Em seguida, foi feito identificado a presença de um valor outlier no grupo NT sem estimulação com T, por meio do teste ROUT. O tratamento estatístico foi feito da seguinte forma: (1) para comparar a geração de NO entre os grupos NT e PE, foi utilizado o teste t para amostras independentes; (2) para comparar os efeitos da T na geração de NO foi utilizado o teste t pareado (considerando vasos de um mesmo grupo sem e com estimulação por testosterona). Os valores de alfa menores do que 5% foram considerados como estatisticamente significativos. 32 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste estudo, foi avaliado o efeito da testosterona sobre a produção in situ de NO em arteríolas placentárias provenientes de gestantes com diagnóstico clínico confirmado de PE comparadas às gestantes NT. A Tabela 1 apresenta as caracterís- ticas das gestantes do grupo NT e PE. Ressaltamos os dados relativos à pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD), um dos principais fatores para que as ges- tantes fossem incluídas em seus respectivos grupos, haja vista que as gestantes do grupo PE apresentaram PAS e PAD superior aos valores de referência (respectiva- mente, ≥140 mmHg e ≥ 90mmHg), enquanto as normotensas apresentaram níveis pressóricos abaixo dos valores de referência para normotensão (PAS ≤ 120 mmHg e pressão arterial diastólica (PAD) ≤ 80mmHg). Tabela 1 – Características das gestantes dos dois grupos experimentais: Normotensa (N=10) Pré-eclâmpsia (N=11) Idade (anos) 26±1,8 28±1,8 Massa corporal (kg) 67±3 68±4 Altura (m) 1,64±0,01 1,60±0,02 IMC gestacional (kg/m2) 25,41±1,3 26,41±1,3 Idade gestacional (semanas) 39,2±0,3 36,4±0,8 Comorbidades pré-gestacional 1(asma) 0 Comorbidades gestacional 0 11(PE)* Uso de medicamentos 6** 7*** Doenças agudas 0 11* Pressão arterial sistólica (mmHg) 112,7±2,6 154±3,5 Pressão arterial diastólica (mmHg) 73,2±1,8 97±2,76 Pressão arterial sistólica pré-parto (mmHg) 114,9±3 160,7±4,8 Pressão arterial diastólica pré-parto (mmHg) 72,2±2,78 102±2,46 Proteinúria 0 11 Nuliparidade (sim/não) 5 7 Peso do feto (kg) 3,2±0,17 2,6±0,2 Fonte: Elaborado pela autora (2025). Nota: As variáveis contínuas estão apresentadas como média±erro padrão da média, enquanto as variáveis categóricas estão apresentadas em frequência absoluta. Os valores de pressão arterial sistólica e diastólica é a média das três medidas no momento do diagnóstico. IMC=índice de massa corporal; PE=pré-eclâmpsia. * As doenças agudas caracterizam-se por Pré-Eclâmpsia. ** Uso de polivitamínicos e sulfato ferroso. *** Uso de Sulfato ferroso, polivitamínico, metildopa e hidralazina. 33 5.1 A PRÉ-ECLÂMPSIA NÃO ALTERA A FORMAÇÃO IN SITU DE NO EM ARTERÍOLAS PLACENTÁRIAS HUMANAS A Figura 4 apresenta a análise da formação in situ de NO em arteríolas placentárias humanas, comparando gestantes NT e aquelas com PE. Os dados demonstram que não houve diferença significativa na produção basal de NO entre os grupos (p = 0,33). Figura 4 – Formação in situ de NO em artérias placentárias de gestantes normotensas e com pré-eclâmpsia Fonte: Elaborado pela autora (2025). Nota: Formação in situ de NO em artérias placentárias de gestantes normotensas (NT, n=6) e com pré-eclâmpsia (PE, n=8). Superior: figura representativa na escala de 250m; Inferior: figura quantitativa. Valores expressos em média±erro padrão da média. Utilizou-se teste t para amostras independentes. 34 É sabido que durante a gestação a atividade da eNOS na placenta e nas artérias uterinas é fundamental para a produção de NO, e consequente aumento do fluxo sanguíneo uteroplacentário (Herur et al., 2022). No tocante às gestações com PE, há evidências de uma redução na biodisponibilidade de NO, que está diretamente associada à disfunção endotelial e à elevação da resistência vascular sistêmica, fatores centrais na fisiopatologia dessa doença (Roberts; Hubel, 2009). Outros estudos, apontam que os níveis circulantes de nitrito e nitrato — metabólitos estáveis derivados do NO — encontram-se diminuídos em mulheres que desenvolvem a PE, sugerindo uma síntese reduzida dessa molécula. Choi et al., (2002) demonstraram que, em gestantes com PE, tanto os níveis de nitrito quanto a soma de nitrito + nitrato estavam significativamente abaixo dos níveis observados em gestantes normotensas (Németh et al., (2018), Rizos et al., (2012)). Observa-se na PE uma resposta inflamatória sistêmica exacerbada, a qual contribui para a disfunção endotelial característica da doença. O estado inflamatório é mediado por uma ativação anormal das células do sistema imunológico materno, incluindo neutrófilos, monócitos/macrófagos e linfócitos T auxiliares, que promovem um aumento na liberação de citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). Havendo um desequilíbrio na resposta das células T, com predominância dos perfis Th1 e Th17 sobre os subtipos anti-inflamatórios Th2 e T reguladoras (Treg), além da considerável ativação de células natural killer (NK) deciduais e células dendríticas, comprometendo a imunotolerância materno-fetal e amplificando a resposta inflamatória local e sistêmica. Essas alterações imunológicas exacerbam o estresse oxidativo e a lesão endotelial, favorecendo a vasoconstrição e o aumento da resistência vascular periférica típicos da PE (Collier et al., 2021). Sankaralingam et al., (2006) discutiram o papel central da inflamação sistêmica na fisiopatologia da pré-eclâmpsia, destacando a ativação imunológica desregulada como um fator chave na gênese da disfunção vascular. Michalczyk et al., (2020) também evidenciam a contribuição das citocinas inflamatórias e do recrutamento leucocitário para a progressão da doença. Já Deer et al., (2023) revisaram amplamente os mecanismos imunológicos envolvidos, incluindo a disfunção de células T e NK, relacionando essas alterações à instalação da hipertensão e ao prejuízo da perfusão placentária. 35 Além da resposta inflamatória, a desregulação do sistema renina- angiotensina (SRA) também participa na gênese da disfunção endotelial na PE. A ativação exacerbada de receptores AT1 por autoanticorpos agonistas leva à vasoconstrição e aumento da expressão de receptor tirosina quinase solúvel Fms-like (sFlt-1) e soluble endoglin (sEng), em um mecanismo que agrava o estado antiangiogênico e hipertensivo da doença. Esse ambiente desfavorável resulta em comprometimento da atividade da eNOS, com consequente redução da produção de NO (Chinnathambi et al., 2014a, 2014b; Mishra; Kumar, 2021). Dessa forma, embora a redução da geração NO represente um dos mecanismos da disfunção endotelial na PE, a complexa fisiopatologia dessa doença sugere que múltiplos sistemas — como os eixos hormonal, imunológico e redox — interagem com a via do NO para o desfecho da doença (Torres-Torres et al., 2024).Nesse contexto, nossos resultados indicam que, nas condições experimentais adotadas, a capacidade das arteríolas placentárias de sintetizar NO não está comprometida na fase final da gestação de mulheres com PE. Estudos demonstram que a expressão e atividade do óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) nas artérias do cordão umbilical de gestantes com PE são comparáveis às observadas em gestantes normotensas. Contudo, a biodisponibilidade de NO nesses vasos encontra-se reduzida na PE. Isso ocorre devido ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), como o ânion superóxido, que reage com o NO para formar peroxinitrito (ONOO⁻), um agente altamente reativo que diminui a disponibilidade de NO. Além disso, a depleção do cofator tetra-hidrobiopterina (BH₄), necessária para a atividade da eNOS, e a depleção do substrato L-arginina, devido à atividade aumentada da arginase II, contribuem para o desacoplamento da eNOS, resultando na produção de ERO em vez de NO (Guerby et al., 2021). Em estudo prévio, 39 gestantes normotensas e 34 com PE tiveram o sangue venoso coletado, respectivamente, em média na 36,5 semana e 35,1 semana para análise dos níveis séricos de nitrato e nitrito utilizando a técnica de cromatografia líquida de alta performance (HPLC, do inglês high performance liquid chromatography). Os resultados não mostraram diferença entre os grupos estudados, indicando não ocorrer mudança na produção de NO na PE (Diejomaoh et al., 2004). Por outro lado, quando realizada a medida de NO, por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA, do inglês enzyme-linked immunosorbent assay) entre 36 gestantes normotensas e com PE, os resultados mostraram diminuição nos níveis séricos de NO em gestantes com PE (Fondjo et al., 2023; Viveka et al., 2023). Adu- Bonsaffoh et al., (2015), utilizando a reação de Griess, também não encontraram diferença significativa nos níveis plasmáticos de NO entre os grupos PE e normotensas, embora tenham observado tendência cognata à correlação inversa entre pressão arterial média e NO, reforçando a possibilidade de que as variações nos metabólitos do NO possam depender de fatores extra cardíacos, técnicas de dosagem e heterogeneidade populacional. Esses resultados indicam que a avaliação da produção de NO quando realizada por métodos que estimam os níveis desse gás por meio de compostos gerados a partir da oxidação do NO (como o nitrato e nitrito), podem produzir resultados divergentes. Por fim, destacamos que não encontramos na literatura avaliação da produção de NO em gestantes com PE por meio da técnica de fluorescência. Sendo assim, evidencia-se na literatura que, apesar de grande parte dos estudos apontar redução de NO na PE, existem evidências relevantes indicando ausência de alteração significativa na síntese ou biodisponibilidade de NO em determinados contextos ou populações, o que demanda cautela na generalização dos achados. 5.2 EM ARTERÍOLAS PLACENTÁRIAS HUMANAS DE GESTANTES NORMOTENSAS E COM PRÉ-ECLÂMPSIA, A FORMAÇÃO in situ DE NO NÃO É ALTERADA PELA EXPOSIÇÃO À TESTOSTERONA Estudos anteriores demonstraram que gestantes com PE apresentam níveis aumentados de testosterona no terceiro trimestre da gestação (Keya et al., 2019; Lan et al., 2020; Sharifzadeh et al., 2012; Serin et al., 2001; Carlsen et al., 2006; Ibrahim et al., 2020). Desta forma, nós resolvemos testar os efeitos da exposição desse hormônio na formação de NO nos vasos placentários de ambos os grupos, que pode ser observado nas Figuras 5 e 6. Os resultados na formação in situ de NO em arteríolas placentárias sem exposição (S/T) e com exposição (T) de testosterona não apresentaram diferença, tanto no grupo de gestantes NT (p=0,10; Fig. 5), quanto PE (p=0,27, Fig. 6). Esse achado sugere que, em gestantes NT e PE, a presença de 37 testosterona na concentração testada não compromete a capacidade das arteríolas placentárias de sintetizar NO. Figura 5 – Avaliação dos efeitos da testosterona na formação de NO em arteríolas placentárias humanas de gestantes normotensas Fonte: Elaborado pela autora (2025). Nota: Formação in situ de NO em arteríolas placentárias sem o efeito (S/T) e com a estimulação de testosterona (T) de gestantes normotensas (NT, n=6). A. Superior: figura representativa na escala de 100m; Inferior: figura quantitativa das gestantes normotensas. B. Superior: figura representativa na escala de 250m; Inferior: figura quantitativa das gestantes normotensas. Valores expressos em média±erro padrão da média. Utilizou-se teste t para amostras pareadas. 38 Figura 6 – Avaliação dos efeitos da testosterona na formação de NO em artérias placentárias humanas de gestantes normotensas Fonte: Elaborado pela autora (2025). Nota: Formação in situ de NO em artérias placentárias sem o efeito (S/T) e com a estimulação de testosterona (T) de gestantes com pré- eclâmpsia (PE, n=8). A. Superior: figura representativa na escala de 100m; Inferior: figura quantitativa das gestantes normotensas. B. Superior: figura representativa na escala de 250m; Inferior: figura quantitativa das gestantes com pré-eclâmpsia. Valores expressos em média±erro padrão da média. Utilizou-se teste t para amostras pareadas. 39 Antes de iniciarmos a discussão desses resultados, devemos ressaltar que para estudar os efeitos da testosterona sobre o vaso sanguíneo, os protocolos devem utilizar diferentes concentrações desse hormônio. Portanto, reconhecemos como uma limitação do nosso estudo o fato de termos submetido os vasos placentários à exposição de uma única concentração de testosterona. Além disso, nós não encontramos na literatura nenhum estudo clínico ou translacional que tenha submetido qualquer tipo de arteríolas de gestantes (com ou sem PE), à exposição de testosterona. Sendo assim, a concentração do hormônio escolhida foi tomando como referência o estudo experimental de Alves et al., (2020) , visto que a concentração de 10-6 M (considerada suprafisiológica) apresentou efeitos prejudiciais na reatividade de anéis de aorta de camundongos, resultado do aumento na formação de espécies reativas de oxigênio mitocondrial. No entanto, nossos resultados não mostraram efeito da exposição à testosterona nessa mesma concentração na formação de NO em arteríolas placentárias de gestantes normotensas e com PE. como a 5α hidrotestosterona (5α T) ou a 5β periféricos, em 17β — (MESIANO & WELSH, 2009). 40 — ⁺]ᵢ), ativando segundas vias de mensageiros e promovendo vasodilatação endotélio-dependente mediada pôr NO. Estudos demonstram que gestantes com PE apresentam níveis elevados de testosterona, o que está correlacionado com disfunção endotelial. A elevação de testosterona pode afetar a produção de NO, contribuindo para a disfunção vascular observada nessa condição (Keya et al., 2019; Lan et al., 2020; Sharifzadeh et al., 2012; Serin et al., 2001; Carlsen et al., 2006; Ibrahim et al., 2020). Estudo de coorte em mulheres com PE (n = 110) revelou que 74,3 % apresentavam níveis elevados de testosterona livre, em comparação com apenas 7,5 % nos controles, com correlação moderada entre testosterona livre e pressão arterial. Este estudo identificou que gestantes com PE apresentaram níveis plasmáticos de testosterona total e livre significativamente superiores aos de gestantes normotensas (213,6 ± 25,9 vs 154,5 ± 14,8 ng/dL; 0,5 ± 0,1 vs 0,3 ± 0,03 ng/dL; p < 0,01) (Amira A. Fathey et al., 2024). Essa correlação entre hiperandrogenia e pressão arterial elevada reforça o papel da testosterona como moduladora endotelial patogênica na PE. Em pesquisa clínica, mulheres com PE apresentaram níveis elevados de testosterona associados a inibição da síntese e liberação de NO e redução da expressão de eNOS — efeitos potencialmente mediadores da disfunção vascular placentária — mesmo sem alteração na produção basal de NO (Possomato-Vieira; Khalil, 2016). observaram efeito vasodilatador com 100 μM de T; já resposta similar em vasos de mulheres a partir de 10 μM. 41 Em condições experimentais, a administração prolongada de testosterona em níveis suprafisiológicos em ratas prenhas desencadeou hipertensão induzida por andrógenos, redução significativa dos níveis séricos de NOₓ e diminuição da vasodilatação endotélio-dependente mediada pôr NO em artérias mesentéricas e uterinas. Essas alterações hormonais modificaram especificamente a regulação da eNOS — diminuição da fosforilação ativadora (Ser¹¹⁷⁷) e aumento da inibidora treonina na posição 495 (Thr⁴⁹⁵) — sem impacto sobre a resposta ao nitroprussiato, sugerindo um mecanismo endotelial específico de ação da testosterona. Simultaneamente, os vasos apresentaram comprometimento nas vias independentes de NO, como Fator Hiperpolarizante Derivado do Endotélio (EDHF) e prostaciclina, reforçando a ideia de que a testosterona exerce efeitos amplos no relaxamento vascular (Chinnathambi et al., 2013). Portanto, embora a exposição aguda à testosterona na dose testada não tenha modificado significativamente a produção de NO in situ em arteríolas placentárias de gestantes normotensas e pré-eclâmpticas (p = 0,27), é plausível que a exposição crônica aos níveis aumentados de testosterona durante a gestação contribua para disfunção vascular na PE. Sendo assim, estudos de natureza translacional adicionais, principalmente utilizando diferentes doses de testosterona, são necessários para elucidar os mecanismos exatos dessas relações e avaliar seu impacto na fisiopatologia da PE. 6. CONCLUSÃO 42 O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da exposição à testosterona sobre a produção de NO em arteríolas placentárias de gestantes normotensas e com pré-eclâmpsia. A análise dos resultados demonstrou que, sob as condições experimentais estabelecidas, a exposição aguda à testosterona não promoveu alterações significativas na formação in situ de NO em ambos os grupos avaliados. Tais achados sugerem que, embora a literatura associe níveis elevados de testosterona a disfunções endoteliais e a uma possível redução na biodisponibilidade de óxido nítrico, os efeitos diretos da testosterona sobre a produção local de NO em arteríolas placentárias podem ser mais complexos do que inicialmente proposto. Fatores como o tempo de exposição, a concentração hormonal, o ambiente oxidativo e as condições vasculares específicas do tecido placentário devem ser considerados na interpretação desses dados. A ausência de diferença observada neste estudo aponta para a necessidade de investigações futuras que contemplem diferentes períodos de exposição à testosterona, avaliações em modelos experimentais in vivo, bem como a análise concomitante de outros mediadores vasculares envolvidos na regulação do tônus placentário, como prostanoides e endotelina-1. Apesar das limitações, este é um trabalho que impôs uma técnica pioneira, podendo contribuir futuramente para o avanço do conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos associados à pré-eclâmpsia, reforçando a importância da modulação hormonal na dinâmica vascular placentária e propondo novas perspectivas do papel da testosterona na gestação patológica. 43 REFERENCIAS Abalos, E., Cuesta, C., Grosso, A. L., Chou, D., & Say, L. (2013). 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