UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI Programa de Pós-Graduação em Biocombustíveis Rafaela Paula Carvalho Pontes ADAPTAÇÃO DE LINHAGENS DE LEVEDURAS FERMENTADORAS DE PENTOSES EM HIDROLISADO DE TORTA DE GIRASSOL PARA PRODUÇÃO DE BIOETANOL Diamantina 2022 Rafaela Paula Carvalho Pontes ADAPTAÇÃO DE LINHAGENS DE LEVEDURAS FERMENTADORAS DE PENTOSES EM HIDROLISADO DE TORTA DE GIRASSOL PARA PRODUÇÃO DE BIOETANOL Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação em Biocombustíveis da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como parte do requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Biocombustíveis. Orientadora: Profª. Drª. Lílian de Araújo Pantoja Coorientador: Prof. Dr. Alexandre Soares dos Santos Diamantina 2022 Catalogação na fonte - Sisbi/UFVJM P814a 2022 Pontes, Rafaela Paula Carvalho ADAPTAÇÃO DE LINHAGENS DE LEVEDURAS FERMENTADORAS DE PENTOSES EM HIDROLISADO DE TORTA DE GIRASSOL PARA PRODUÇÃO DE BIOETANOL [manuscrito] / Rafaela Paula Carvalho Pontes. -- Diamantina, 2022. 113 p. : il. Orientador: Prof. Lílian de Araújo Pantoja. Coorientador: Prof. Alexandre Soares dos Santos. Dissertação (Mestrado em Biocombustíveis) -- Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Programa de Pós- Graduação em Biocombustíveis, Diamantina, 2022. 1. Micro-organismos. 2. Aclimatação celular. 3. Inibidores. 4. Etanol lignocelulósico. 5. Hidrólise ácida. I. Pantoja, Lílian de Araújo. II. Santos, Alexandre Soares dos. III. Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri. IV. Título. Elaborada pelo Sistema de Geração Automática de Ficha Catalográfica da UFVJM com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). Este produto é resultado do trabalho conjunto entre o bibliotecário Rodrigo Martins Cruz/CRB6- 2886 e a equipe do setor Portal/Diretoria de Comunicação Social da UFVJM RAFAELA PAULA CARVALHO PONTES ADAPTAÇÃO DE LINHAGENS DE LEVEDURAS FERMENTADORAS DEPENTOSES EM HIDROLISADO DE TORTA DE GIRASSOL PARAPRODUÇÃO DE BIOETANOL D i s s e r t a ç ã o a p r e s e n t a d a a o MESTRADO EM BIOCOMBUSTÍVEIS, nível de MESTRADO como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRA EM BIOCOMBUSTÍVEIS Data da aprovação : 01/08/2022 Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Lílian De Araújo Pantoja Prof.Dr. JOSÉ IZAQUIEL SANTOS DA SILVA - UFVJM Prof.Dr.ª LÍLIAN DE ARAÚJO PANTOJA - UFVJM Prof.Dr. RICARDO SALVIANO DOS SANTOS - IF SUDESTE MG Prof.Dr.ª SILVANA DE QUEIROZ SILVA - UFOP DIAMANTINA SILVANA DE QUEIROZ SILVA:12610346867 Assinado de forma digital por SILVANA DE QUEIROZ SILVA:12610346867 Dados: 2022.08.02 20:16:45 -03'00' AGRADECIMENTOS Um novo ciclo se fecha e eu não seria capaz de realizá-lo se não fossem pessoas que estiveram ao meu lado. Elas me ajudaram a realizar esse lindo sonho: ser pesquisadora. Portanto, dedico esse trabalho: À Deus, pois desde o primeiro momento coloquei este sonho em Suas mãos e se hoje o realizo é porque meu Senhor sonhou junto comigo. Aos meus queridos orientadores, Profª. Drª. Lílian e Prof. Dr. Alexandre, que se tornaram meus pais acadêmicos. Agradeço a orientação, atenção e todos os ensinamentos que dedicaram a mim. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Biocombustíveis (PPGBiocombustíveis), que sempre foram solícitos e dispostos a ajudarem durante todo processo de pesquisa e construção dessa dissertação. Aos meus pais e minha irmã, que são minha base e meu sustento. Obrigada por não largarem minha mão. Aos meus amigos do laboratório, que hoje se tornaram minha família, agradeço por todo auxílio e companheirismo, principalmente nas madrugadas que precisamos pernoitar na faculdade para a realização desse projeto. À cada um dos meus familiares e também aos meus amigos de longa data. Vocês sempre torceram pelas minhas conquistas e eu não seria nada sem vocês. Um agradecimento especial para àqueles que não puderam estar aqui para comemorar essa conquista e que sinto uma imensa saudade todos os dias. À CAPES e FAPEMIG, pelo financiamento que me permitiu dedicar integralmente ao estudo, e à UFVJM e PPGBiocombustíveis que possibilitaram a realização dessa pesquisa. À todos que contribuíram direta e indiretamente para finalização desse estudo, meu sincero obrigada. RESUMO A produção de bioetanol lignocelulósico é um processo capaz de agregar valor a resíduos agroindustriais. A torta de girassol, proveniente da extração do óleo das sementes do girassol também pode se beneficiar deste processo. No entanto, esta biomassa precisa ser submetida a uma hidrólise para liberação dos açúcares fermentescíveis, podendo gerar inibidores (furanos, compostos fenólicos e ácidos alifáticos) capazes de interferir negativamente no processo da fermentação alcoólica, diminuindo o rendimento do processo. Neste contexto, este estudo teve por objetivo adaptar as linhagens de leveduras não convencionais Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G, capazes de fermentar açúcares C5 e C6, à condição do hidrolisado da torta de girassol obtido por hidrólise com H2SO4 diluído. As linhagens foram submetidas à identificação morfológica para fins de autenticação. A torta de girassol foi preparada em laboratório por extração do óleo das sementes com solvente e caracterizada quimicamente. Os principais componentes do hidrolisado ácido da torta de girassol foram determinados cromatograficamente. O processo de adaptação evolutiva das linhagens estudadas foi realizado através de fermentações sucessivas em meios contendo diferentes concentrações da fração solúvel do hidrolisado (25%-100% v/v), seguido de isolamento das leveduras. Os processos fermentativos com as leveduras adaptadas foram conduzidos em meio contendo 100% de hidrolisado e monitorados quanto à viabilidade celular, crescimento microbiano, consumo dos açúcares, teor de etanol, produtividade volumétrica, rendimento de etanol e eficiência fermentativa. Os ensaios morfológicos macro e microscópicos permitiram constatar a pureza das culturas estudadas. O hidrolisado mostrou a presença de compostos tóxicos como 5-hidroximetilfurfural (0,30±0,02 g L-1), furfural (0,01±0,01 g L-1) e ácido acético (3,81±0,21 g L-1). A levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 demonstrou ser resiliente no ambiente do hidrolisado, não havendo alteração significativa do comportamento fermentativo pós adaptação, e apresentou YP/S de 0,43±0,10 g g-1 e QP de 0,35±0,01. A levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G adaptada em 50% de hidrolisado demonstrou melhora na produtividade volumétrica que foi de 0,32±0,04 para 0,42±0,01 g L-1 h-1 e melhora no rendimento de etanol, onde o valor passou de 0,34±0,03 para 0,50±0,02 g g-1. Palavras-chave: micro-organismos, aclimatação celular, inibidores, etanol lignocelulósico, hidrólise ácida. ABSTRACT The production of lignocellulosic bioethanol is a process capable of adding value to agro- industrial waste. Sunflower cake from the extraction of oil from sunflower seeds can also benefit from this process. However, this biomass needs to be submitted to hydrolysis to release fermentable sugars, and can generate inhibitors (furans, phenolic compounds and lyic acids) capable of negatively interfering in the process of alcoholic fermentation, reducing the process yield. In this context, this study aimed to adapt the unconventional yeast lines Candida akabanensis UFVJM-R131 and Candida orthopsilosis UFVJM-4G, capable of fermenting sugars C5 and C6, to the condition of sunflower pie hydrolyzed obtained by hydrolysis with H2SO4 diluted. The strains were submitted to morphological identification for authentication purposes. The sunflower cake was prepared in the laboratory by extracting the oil from the seeds with solvent and chemically characterized. The main components of the acid hydrolysate of the sunflower cake were determined chromatographically. The process of evolutionary adaptation of the studied strains was carried out through successive fermentations in media containing different concentrations of the soluble fraction of hydrolyzed (25%-100% v/v), followed by yeast isolation. The fermentative processes with the adapted yeasts were conducted in a medium containing 100% hydrolyzed and monitored for cell viability, microbial growth, sugar consumption, ethanol content, volumetric yield, ethanol yield and fermentative efficiency. The macro and microscopic morphological tests showed the purity of the studied cultures. Hydrolyzed showed the presence of toxic compounds such as 5- hydroxymethylfurfural (0.30±0.02 g L-1), furfural (0.01±0.01 g L-1) and acetic acid (3.81±0.21 g L-1). The yeast Candida akabanensis UFVJM-R131 showed to be resilient in the hydrolyzed environment, with no significant change in the fermentative behavior after adaptation, and presented YP/S of 0.43±0.10 g g-1 and QP of 0.35±0.01. The yeast Candida orthopsilosis UFVJM-4G adapted in 50% of hydrolyzed showed improvement in volumetric productivity that went from 0.32±0.04 to 0.42±0.01 g L-1 h-1 and improvement in ethanol yield, where the value went from 0.34±0.03 to 0.50±0.02 g g-1. Keywords: microorganisms, cellular acclimatization, inhibitors, lignocellulosic ethanol, acid hydrolysis. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Quatro gerações de produção de etanol com base na matéria-prima. ....................... 22 Figura 2. Composição da biomassa vegetal.............................................................................. 23 Figura 3. Estrutura complexa da biomassa lignocelulósica ...................................................... 25 Figura 4. Esquema dos principais inibidores gerados a partir do tratamento ácido do material lignocelulósico .......................................................................................................................... 28 Figura 5. Efeitos inibitórios dos derivados de furano, ácidos alifáticos, compostos fenólicos para a célula leveduriforme. ..................................................................................................... 29 Figura 6. Conversão dos monossacarídeos provenientes da fração hemicelulósica na célula leveduriforme............................................................................................................................ 32 Figura 7. Fluxograma das etapas para adaptação celular das linhagens de leveduras Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G, utilizando hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol ........................................................................................... 40 Figura 8. Ensaios morfológicos para autenticação dos micro-organismos .............................. 50 Figura 9. Representação esquemática de uma câmara de biocultivo ou microcultivo utilizada no preparo das lâminas para visualização microscopica das leveduras estudadas. ....................... 53 Figura 10. Esquema do procedimento utilizado para aclimatação de células de leveduras C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G em hidrolisado ácido de torta de girassol. ..................................................................................................................................... 58 Figura 11. Fluxograma representativo das etapas de fermentação em hidrolisado hemicelulósico de girassol puro com as células das linhagens C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G aclimatadas. .......................................................................................................... 61 Figura 12. Desenho esquemático da Câmara de Neubauer ...................................................... 63 Figura 13. Aspecto morfológico macroscópico da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 em meio YMPDX (A), YMPD (B), YPX (C) e ágar-ágar AA (D) após 96 horas de crescimento. ......................................................................................................................... 69 Figura 14. Aspecto morfológico macroscópico da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G em meio YMPDX (A), YMPD (B), YMPX (C) e ágar-ágar AA (D) após 96 horas de crescimento. ......................................................................................................................... 70 Figura 15. Aspecto morfológico microscópico da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 em meios A) e B) YMPX, em lente de aumento de 40x, C) YPX, em lente de aumento de 40x e D) ágar-ágar AA em lente de aumento de 100x. ......................................... 72 Figura 16. Aspecto morfológico microscópico da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G em meios A) e B) YMPD, em lente de aumento de 100x, C) YPX, em lente de aumento de 40x, D) Ágar-acetato AC em lente de aumento de 40x, E) ágar-ágar AA em lente de aumento de 40x. ................................................................................................................... 73 Figura 17. Perfil de crescimento e de consumo de açúcar da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 quando cultivada em meio YPMX .............................................. 74 Figura 18. Relação entre densidade óptica e peso seco de um cultivo de Candida akabanensis UFVJM-R131 em meio sintético YPMX. ................................................................................ 75 Figura 19. Perfil de crescimento e de consumo de açúcar da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G quando cultivada em meio YPMX ................................................. 76 Figura 20. Relação entre densidade óptica e peso seco de um cultivo de Candida orthopsilosis UFVJM-4G em meio sintético YPMX. .................................................................................... 77 Figura 21. Curva de crescimento microbiano da levedura Candida akabanensis em meio sintético (H0), meio contendo 25% de hidrolisado (H25), 50% de hidrolisado (H50), 75% de hidrolisado (H75) e meio contendo apenas hidrolisado (H100). .............................................. 78 Figura 22. Curva de crescimento microbiano da levedura Candida orthopsilosis em meio sintético (H0), contendo 25% de hidrolisado (H25), 50% de hidrolisado (H50), 75% de hidrolisado (H75) e meio contendo apenas hidrolisado (H100). .............................................. 78 Figura 23. Aspecto morfológico microscópico, em lente de aumento de 40x, das leveduras A) Candida akabanensis UFVJM-R131 e B) Candida orthopsilosis UFVJM-4G utilizadas como inóculo para iniciar o processo de aclimatação. ....................................................................... 79 Figura 24. Aspecto morfológico microscópico da levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 após crescimento em meio A) H25, B) H50, C) H75, D) H100, observadas em lente de aumento de 100x. .................................................................................................................................... 80 Figura 25. Aspecto morfológico microscópico da levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G após crescimento em meio A) H25, B) H50, C) H75, D) H100, observadas em lente de aumento de 40x. ...................................................................................................................................... 81 Figura 26. Perfil de consumo de açúcares redutores das linhagens de leveduras Candida akabanensis UFVJM-R131, não aclimatada e aclimatadas, e Candida orthopsilosis UFVJM- 4G, não aclimatada e aclimatadas............................................................................................. 82 Figura 27. Perfil de consumo de açúcares (glicose, xilose e arabinose), produção de etanol e crescimento celular durante fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol pela linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 não aclimatada (R131-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (R131-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (R131-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (R131- A75) e aclimatada em hidrolisado (R131-A100). .................................................................... 83 Figura 28. Consumo de glicose (A) e xilose (B) pela levedura Candida akabanensis UFVJM- R131 em fermentação com hidrolisado ácido de farelo de girassol. ........................................ 84 Figura 29. Perfil de crescimento das células da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 não aclimatada (A0) e aclimatadas (R131-A25 e R131-A100) em hidrolisado hemicelulósico de farelo de girassol. ........................................................................................ 85 Figura 30. Quantidade de células vivas e mortas e viabilidade celular da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 não aclimatada (R131-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (R131-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (R131-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (R131-A 75) e aclimatada em hidrolisado (R131-A100). ......................................................................................................... 86 Figura 31. Quantidade de células vivas e mortas e viabilidade celular da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G não aclimatada (4G-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (4G-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (4G-AA50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (4G-A 75) e aclimatada em hidrolisado (4G-A100). ............................................................................................................................... 88 Figura 32. Perfil de consumo de açúcares redutores da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G, não aclimatada (4G-A0) e aclimatadas (4G-A25 a 4G-A100) ...... 90 Figura 33. Perfil de consumo de açúcares (glicose, xilose e arabinose), produção de etanol e crescimento celular durante fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol pela linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G não aclimatada (4G-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (4G-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (4G-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (4G-A75) e aclimatada em hidrolisado (4G-A100). .................................................................................... 91 Figura 34. Consumo de glicose (A) e xilose (B) pela levedura Candida orthopsilosis UFVJM- 4G em fermentação com hidrolisado ácido de farelo de girassol. ............................................ 92 Figura 35. Perfil de crescimento das células da linhagem de levedura e Candida orthopsilosis UFVJM-4G em hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol. ............................................ 93 Figura 36. Quantidade de células vivas e mortas e viabilidade celular da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G não aclimatada (4G-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (4G-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (4G-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (4G-A 75) e aclimatada em hidrolisado (4G- A100).Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. ............................................................................. 95 Figura 37. Concentração dos compostos glicerol, ácido acético, 5-hidroximetilfurfural e furfural durante fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol a partir da levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G não aclimatada (4G-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (4G-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (4G-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (4G-A75) e aclimatada em hidrolisado (4G- A100). ....................................................................................................................................... 96 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Adaptação de diferentes micro-organismos em diferentes hidrolisados visando a produção de bioetanol de segunda geração .............................................................................. 37 Tabela 2. Padrões utilizados na quantificação dos compostos químicos ................................. 48 Tabela 3. Condições operacionais empregadas na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para as análises de açúcares, ácido acético, furfural, 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) e glicerol, no hidrolisado ácido lignocelulósico .......................................................................... 48 Tabela 4 - Principais variações na morfologia de colônias de leveduras ................................. 51 Tabela 5. Meios de culturas utilizados para observar as características macro e microscópicas das linhagens Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G. .... 52 Tabela 6 - Representação esquemática das principais características da morfologia celular de leveduras (forma, reprodução e polaridade .............................................................................. 54 Tabela 7. Composição dos meios fermentativos empregados na etapa de estudo da aclimatação das leveduras C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G em hidrolisado ácido de torta de girassol. ......................................................................................................... 59 Tabela 8. Siglas utilizadas para nomear células das leveduras Candida akabanensis UFVJM- R131 e Candida akabanensis UFVJM-R131 aclimatadas em diferentes condições................ 62 Tabela 9. Composição centesimal do farelo de semente de girassol (Helianthus annuus L.) .. 67 Tabela 10. Composição química do hidrolisado ácido hemicelulósico do farelo de girassol .. 68 Tabela 11. Tamanho das colônias da linhagem Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G em função do tempo em diferentes meios de cultivo ..................... 71 Tabela 12. Viabilidade celular das células das leveduras Candida akabanensis UFVJM-R131 aclimatadas e não aclimatada durante o processo de fermentação em hidrolisado hemicelulósico de girassol ................................................................................................................................. 85 Tabela 13. Parâmetros de crescimento da fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol com a levedura Candida akabensis UFVJM-R131 não aclimatada (R131-A0) e aclimatada (R131-A25, R131-A50, R131-A75, R131-A100) .................................................................... 87 Tabela 14. Parâmetros do processo fermentativo conduzido com as linhagens aclimatadas e não aclimatadas da levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 em hidrolisado hemicelulósico de semente de girassol .............................................................................................................. 89 Tabela 15. Parâmetros de crescimento da levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 ...... 93 Tabela 16. Viabilidade celular das células da levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G aclimatadas durante o processo de fermentação em hidrolisado hemicelulósico de girassol .. 94 Tabela 17. Parâmetros do processo fermentativo conduzido com as linhagens aclimatadas e não aclimatadas da levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G, em hidrolisado ácido de farelo de semente de girassol ................................................................................................................... 97 Tabela 18. Comparação do desempenho da fermentação de diferentes leveduras utilizando hidrolisado ................................................................................................................................ 99 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A0 – Levedura isolada após fermentação em meio H0 A25 – Levedura isolada após fermentação em meio H25 A50 – Levedura isolada após fermentação em meio H50 A75 – Levedura isolada após fermentação em meio H75 A100 – Levedura isolada após fermentação em meio H100 AR - Açúcares redutores AST - Açúcares solúveis totais CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência D.O - Densidade óptica DNS - Ácido dinitrosalicílico Ef % - Eficiência fermentativa em porcentagem FDA - Fibra em detergente ácido FDN - Fibra em detergente neutro GEE - Gases de Efeito Estufa H0 – Meio sintético de composição 50 g L-1 de D-xilose, 1,25 g L-1 de ureia, 1,1 g L-1 KH2PO4, 2,0 g L-1 de extrato de levedura 40,0 mL L-1 de solução de sais minerais e ácido cítrico. H25 – Meio sintético adicionado de 25% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico de girassol. H50 - Meio sintético adicionado de 50% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico de girassol. H75 - Meio sintético adicionado de 75% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico de girassol. H100 - Meio fermentativo composto de hidrolisado hemicelulósico de girassol. MME - Ministério de Minas e Energia Qp - Produtividade volumétrica S/L - Sólido-Líquido. SisGen - Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado tg - tempo de geração celular µmáx – velocidade de crescimento microbiano máxima YMPD - Yeast Extract-Malt-Peptone-Dextrose YMPX -Yeast Extract-Malt-Peptone-Xylose YMPDX -Yeast Extract-Malt-Peptone-Dextrose-Xylose YP/S - Rendimento em etanol Sumário 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 17 2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 19 2.1 Objetivo Geral ................................................................................................................. 19 2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................................... 19 3 REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................ 21 3.1 Biocombustíveis ............................................................................................................... 21 3.2 Bioetanol ........................................................................................................................... 22 3.3 Biomassa lignocelulósica ................................................................................................. 24 3.4 Compostos inibidores do processo fermentativo .......................................................... 28 3.4 Torta de Girassol ............................................................................................................. 30 3.5 Leveduras ......................................................................................................................... 31 3.6 Leveduras Fermentadoras de Pentose ........................................................................... 31 3.7 Adaptação celular ............................................................................................................ 34 4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 39 4.1 Obtenção e extração do óleo da semente de girassol .................................................... 41 4.2 Caracterização centesimal da biomassa desengordurada ........................................... 41 4.2.1 Preparo das amostras ..................................................................................................... 41 4.2.2 Determinação da umidade.............................................................................................. 41 4.2.3 Determinação do teor de cinzas ..................................................................................... 42 4.2.4 Determinação dos lipídios remanescentes ..................................................................... 42 4.2.5 Determinação de Proteínas Totais ................................................................................. 43 4.2.6 Determinação de Fibra em Detergente Ácido (FDA) .................................................... 43 4.2.7 Determinação de Fibra em Detergente Neutro (FDN) .................................................. 44 4.2.8 Determinação da celulose (Cel) ..................................................................................... 45 4.2.9 Determinação de Lignina em Detergente Ácido (LDA) e Cinzas (CZ) .......................... 45 4.2.10 Determinação da hemicelulose .................................................................................... 46 4.2.11 Determinação de Amido e Açúcares Solúveis Totais (AST) ......................................... 47 4.3 Preparo e Caracterização do Hidrolisado Hemicelulósico de torta de girassol ......... 47 4.4 Reativação e manutenção dos micro-organismos ......................................................... 49 4.5 Autenticação dos micro-organismos fermentadores de pentose ................................. 49 4.6 Curva de crescimento ...................................................................................................... 55 4.6.1 Preparo do inóculo ......................................................................................................... 55 4.6.2 Processo fermentativo .................................................................................................... 55 4.6.3 Monitoramento do processo ........................................................................................... 55 4.7 Adaptação/aclimatação celular das linhas C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G ....................................................................................................... 58 4.7.1 Processo fermentativo de aclimatação ........................................................................... 59 4.7 Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de girassol com células aclimatadas ... 60 4.7.2 Monitoramento do Processo ........................................................................................... 62 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 67 5.1 Caracterização centesimal da biomassa ........................................................................ 67 5.2 Caracterização do hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol ............................ 68 5.3 Reativação e autenticação dos micro-organismos ........................................................ 68 5.4.1 Caracterização e identificação morfológica das leveduras ........................................... 69 5.5 Curva de crescimento microbiano ................................................................................. 73 5.6 Adaptação Celular ........................................................................................................... 77 5.7 Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol ............................... 81 5.7.1 Candida akabanensis UFVJM-R131 ............................................................................ 81 5.7.2 Candida orthopsilosis UFVJM-4G ............................................................................... 89 6 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 101 7 PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................................. 103 8 REFERÊNCIAS...................................................................................................102 17 1 INTRODUÇÃO A necessidade de redução dos gases de efeito estufa (GEE), a limitação das reservas de petróleo, bem como a crescente discussão sobre desenvolvimento sustentável resultam na busca por alternativas energéticas proveniente de fontes renováveis (HOLMATOV et al., 2021; REIS; GONÇALVES; FREITAS, 2022). Dentre essas fontes, o bioetanol é uma das alternativas para substituir e ou subsidiar os combustíveis fósseis no setor de transporte. O bioetanol de segunda geração é produzido através da utilização de biomassas lignocelulósicas e agregam valor à resíduos que seriam descartados sem destino (SADHUKHAN et al., 2019; ALMEIDA; NASCIMENTO, 2021), bem como, reduz as emissões de gases do efeito estufa (TOOR et al., 2020), não compete por fontes alimentícias (KUMAR et al., 2020; ZUCARO et al., 2016) e ainda, pode influenciar de forma positiva na economia agroindustrial (LIU et al., 2020). A biomassa lignocelulósica se constitui em um material de estrutura naturalmente resistente, tendo como principais componentes químicos a celulose, a hemicelulose e a lignina, que estão entrelaçados por ligações covalentes, ligação de hidrogênio e forças de Van der Waals (VELVIZHI et al., 2022). A celulose e a hemicelulose, quando hidrolisadas, fornecem carboidratos monoméricos tais como, D-glicose, D-xilose e L-arabinose (KO; UM; LEE, 2016; KUMAR et al., 2020), que podem ser utilizados por diferentes micro-organismos fermentadores para produção de bioetanol. No entanto, a complexidade presente na estrutura da biomassa lignocelulósica limita o acesso dos micro-organismos aos carboidratos, necessitando assim, de um processo capaz de alterar a recalcitrância da parede celular (YOO et al., 2020). Essa resistência pode ser quebrada por diferentes pré-tratamentos, tais como físicos, biológicos, térmicos e químicos (SADHUKHAN et al., 2019). Dentre os vários métodos citados o pré-tratamento químico utilizando ácido diluído é amplamente aplicado com a finalidade de ocasionar uma ruptura na matriz estrutural da biomassa lignocelulósica pela degradação da hemicelulose (CANDIDO; MORI; GONÇALVES, 2019; ROJAS-CHAMORRO et al., 2020). Todavia, as condições severas do pré-tratamento ácido podem acarretar a formação de compostos químicos inibidores do processo fermentativo, tais como ácidos alifáticos, derivados de furanos e compostos fenólicos (PRASAD et al., 2018). Esses compostos podem atuar na estrutura e no metabolismo microbiano resultando em um efeito citotóxico e ou deletério ao agente fermentativo (HEMANSI et al., 2022). O agente fermentativo dominante no processo de produção de etanol industrial é a levedura Saccharomyces cerevisiae, devido à sua excepcional tolerância ao etanol e alta 18 resistência aos inibidores fermentativos liberados durante a hidrólise (KO et al., 2020; LANE et al., 2020). Contudo, esse micro-organismo não é capaz de utilizar todos os açúcares disponíveis na biomassa lignocelulósica, ou seja, hexoses e pentoses (NANDAL; SHARMA; ARORA, 2020). Uma alternativa para o aproveitamento integral desses açúcares provenientes das biomassas lignocelulósicas seria a obtenção de micro-organismos naturalmente ocorrentes capazes de converter pentoses em etanol (LEE, et al., 2021). Nos dias atuais, ainda não existem relatos dessas linhagens capazes de metabolizar todos os açúcares presentes no hidrolisado lignocelulósico a etanol com semelhante desempenho ao da levedura S. cerevisiae em metabolizar hexoses (KUMAR; SINGH; GHOSH, 2022; LANE et al., 2020; TRAN et al., 2020). Visando contribuir com alternativas para minimizar este problema, o grupo de pesquisa Bioprospecção Microbiana da UFVJM isolou e identificou leveduras fermentadoras de pentose, bem como avaliou seu potencial para produção de bioetanol. Dentre essas linhagens encontram-se as leveduras Candida akabanensis UFVJM-R131, isolada de bagaço de cana-de- açúcar e Candida orthopsilosis UFVJM-4G, isolado de arroz doce. Valinhas et al. (2018) e Barbosa (2017) relataram que essas linhagens ainda não haviam sido relacionadas na literatura como potenciais micro-organismos produtores de bioetanol, abrindo um leque de indagações futuras. Matos et al. (2017) estudando a linhagem C. akabanensis UFVJM-R131 observou sua capacidade em converter os açúcares disponíveis na fração hemicelulósica do hidrolisado de torta de girassol a etanol, mesmo na presença de inibidores celulares. No presente estudo, com o intuito de melhorar a tolerância das leveduras fermentadoras de pentoses Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G frente aos inibidores celulares e aprimorar o rendimento e a produtividade da fermentação alcoólica, esses micro-organismos foram submetidos ao processo de adaptação celular (aclimatação) em hidrolisado hemicelulósico de girassol. De acordo com Opalek e Wloch-Salamon (2020) a adaptação é um método utilizado para melhorar características genotípicas microbianas, tais como tolerância aos inibidores, sensibilidade à temperatura, bem como a produção de bioetanol a partir de substratos lignocelulósicos. Cabe mencionar que são inauditos os relatos de pesquisas na literatura que abordam sobre as características morfológicas e fisiológicas dessas espécies de leveduras, não convencionais, bem como seu papel metabólico na produção de etanol a partir de hexoses e ou pentoses. Nesse sentido, o presente estudo apresenta os objetivos descritos a seguir. 19 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Selecionar células das linhagens Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G resilientes e eficientes na fermentação alcoólica de pentoses contidas em hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol através de pressão seletiva. 2.2 Objetivos Específicos Objetivos específicos Metas Caracterizar as linhagens de leveduras estudadas macro e microscopicamente Reativar e autenticar as leveduras Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G conservadas em meio com 10% glicerol. Determinar as características químicas do hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol Caracterizar físico-quimicamente o hidrolisado ácido hemicelulósico de torta de girassol por meio das determinações analíticas de acidez, inibidores (5-hidroximetilfurfural, furfural e ácido acético), açúcares (açúcares redutores totais, glicose, xilose e arabinose) e glicerol. 4 Estudar o desempenho das linhagens de leveduras fermentadoras de pentoses para a produção de etanol em meio composto por hidrolisados hemicelulósicos de torta de girassol. 4.1 Submeter as linhagens de leveduras estudadas a um processo de adaptação (aclimatação) em meios de cultivo contendo diferentes concentrações de hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol. 4.2 Avaliar o desempenho das linhagens de leveduras sem aclimatação no processo fermentativo conduzido com meio composto por hidrolisados hemicelulósicos de torta de girassol para a produção de etanol. 4.3 Investigar o desempenho das linhagens de leveduras aclimatadas no processo fermentativo para a produção de etanol, conduzido com meio sintético. 4.4 Investigar o perfil cinético do processo fermentativo por meio de análises químicas (açúcares redutores e totais, glicose, xilose, ácidos orgânicos e etanol) e variáveis de resposta dos processos atreladas ao crescimento celular, consumo de substrato e produção de etanol (µmáx, tg, YP/S, QP, Ef, ΔX, ΔP, ΔS). 20 21 3 REFERENCIAL TEÓRICO 3.1 Biocombustíveis Os combustíveis de origem fóssil são compostos de carbono não renováveis e sua combustão origina gases que acumulados na atmosfera contribuem para o aquecimento global (REIS; GONÇALVES; FREITAS, 2022) . O aquecimento global e as alterações climáticas, atrelado ao aumento da demanda de energia são grandes motivadores do intenso estudo e desenvolvimento de alternativas energéticas renováveis (MAIA; BOZELLI, 2022). Matérias- primas renováveis, como biomassas lignocelulósicas, são consideradas potenciais fontes de energia alternativas ao petróleo. O Brasil é considerado um dos principais países capazes de utilizar matérias-primas renováveis, sendo estas empregadas em 45% da energia total e nos 18% dos combustíveis líquidos consumidos no país (ANP, 2020). O governo brasileiro incentiva o uso de biocombustíveis através de programas nacionais, tais como o Pró-álcool, sancionado na década de 1970 (LORENZI; ANDRADE, 2019). No âmbito brasileiro, a indústria sucroalcooleira possui uma importância considerável para a economia do país, visto que, além de atuar como um dos maiores exportadores de açúcar, o caldo de cana-de-açúcar é utilizado para a produção de bioetanol, sendo esse álcool conhecido como etanol de primeira geração (1G) (JUNIOR et al., 2021; PEREIRA; MILAN; TAPIA-BLÁCIDO, 2021). O Brasil é o segundo maior produtor de etanol no mundo e possui 386 usinas de cana-de-açúcar, das quais, 63% (245) representadas por usinas mistas, que produzem etanol e açúcar, 31% (121) por usinas que produzem somente etanol e 5% (20) por usinas que produzem somente açúcar (JUNIOR et al., 2021; RAJ et al., 2022). Com a criação da nova Política Nacional de Biocombustíveis (RenovaBio), instituído em 2017, o cenário brasileiro ainda tende a progredir (LORENZI; ANDRADE, 2019). Os principais objetivos do programa são: promover o aumento da produção dos biocombustíveis, garantir mercado para os biocombustíveis na matriz energética do transporte brasileiro, bem como diminuir as emissões de gases de efeito estufa (GEE) em 43% em relação as emissões no ano de 2005 (GRASSI; PEREIRA, 2019) . Para isso, o Ministério de Minas e Energia (MME) sugere aumentar a produção de etanol de 28 bilhões de litros, quantidade produzida no ano de 2017, para 54 bilhões até o ano de 2030 (LORENZI; ANDRADE, 2019). Apesar do país ser destaque na produção desse biocombustível, o bioetanol de segunda geração (2G) ainda é incipiente no Brasil, representando menos de 1% do volume de etanol produzido. Apenas duas empresas brasileiras produzem etanol de segunda geração, sendo um em São Miguel dos Campos, no Estado de Alagoas (Bioflex 1, da GranBio) e outra no 22 município de Piracicaba, no Estado de São Paulo (Raízen), que utilizam como matéria-prima o bagaço de cana-de-açúcar (ABUD, 2019). Levando em consideração que o bioetanol 2G pode ser produzido a partir de diversas biomassas residuais com grande disponibilidade no mercado, há uma necessidade de estudos nessa área para aprimorar a implementação dessa tecnologia no país. 3.2 Bioetanol O bioetanol pode ser produzido utilizando diversas matérias-primas, tais como biomassas sacarinas (cana-de-açúcar, beterraba e sorgo sacarino), biomassas amiláceas (milho, mandioca, trigo e cevada), e biomassas lignocelulósicas (madeira, resíduo florestal, palha e gramíneas) (HOLMATOV et al., 2021). A Figura 1 apresente de forma esquemática e simplificada os processos de produção do bioetanol de 1°, 2° e 3° geração. Fonte: Autoria Própria (2022) com base em Abud e Silva (2019). Figura 1. Quatro gerações de produção de etanol com base na matéria-prima. O combustível proveniente das biomassas sacarinas e amiláceas é conhecido como etanol de primeira geração (1G) (LIU et al., 2020; ROBAK; BALCEREK, 2018). A biomassa sacarina possui açúcares livres, sacarose, glicose e frutose, capazes de serem metabolizados em 23 etanol, enquanto a biomassa amilácea é rica em amido (RUCHALA et al., 2020). O amido é constituído por monômeros de glicose que se encontram conectadas por ligações glicosídicas α-1,4 e α-1,6 que podem ser facilmente quebradas, através do uso de enzimas adequadas, a biomassa pode ser transformada em um caldo rico de açúcares monoméricos fermentáveis (LAMOUNIER et al., 2020). Entretanto, a biomassa lignocelulósica, cujo biocombustível produzido a partir da mesma é conhecido por bioetanol de segunda geração (2G), necessita de etapas precedentes para disponibilizar os açúcares monoméricos aos agentes fermentativos (ALAYOUBI et al., 2020) como representado na Figura 2. Fonte: CORRÉIA, 2011 (adaptada). Figura 2. Composição da biomassa vegetal De acordo com Lamounier et al. (2020), o processo de conversão dos materiais lignocelulósicos em bioetanol requer diversas etapas, sendo a primeira etapa o pré-tratamento. Esses autores também relatam que a etapa de pré-tratamento garante a remoção da lignina, a redução da cristalinidade da celulose, bem como o aumento da porosidade do material. A próxima etapa é conhecida como hidrólise, que tem como finalidade despolimerizar os componentes holocelulósicos, liberando os monossacarídeos livres, tais como pentoses e 24 hexoses (PRIHARTO et al., 2020; RAJENDRAN et al., 2018). Por último, a etapa de fermentação, que garante a conversão dos açúcares monoméricos livres em bioetanol, sendo este destilado para o uso (ALMEIDA; NASCIMENTO, 2021; COOPER et al., 2020). A conversão da biomassa lignocelulósica em álcool requer etapas que deixam o processo mais trabalhoso e caro, todavia apresenta diversos benefícios (ACHINAS; EUVERINK, 2016; PHAM et al., 2020; SADHUKHAN et al., 2019) dentre estes, aqueles relacionados a biomassas lignocelulósicas, tais como o custo ser relativamente baixo e serem prontamente disponível no meio ambiente, como os resíduos agrícolas, resíduos industriais e materiais cultivados (bagaço de cana-de-açúcar, palha de trigo, espiga de milho e casca de arroz) (HEGELY; LANG, 2020; ROBAK; BALCEREK, 2018)). Além disso, a produção a partir dessa matéria-prima não compete diretamente com os suprimentos alimentares e com a terra arável, evitando a degradação do solo e da água devido à adubação e uso de pesticidas, adversidades que envolvem a fabricação dos biocombustíveis de primeira geração (MACHINENI, 2019). 3.3 Biomassa lignocelulósica Materiais lignocelulósicos, como resíduos agrícolas, resíduos florestais, gramíneas e materiais lenhosos têm grande potencial para a produção de biocombustíveis. Normalmente, a maior parte da biomassa lignocelulósica agrícola é composta por cerca de 10% - 25% de lignina, 20% - 30% de hemicelulose, e 40% - 50% de celulose (SHAHZADI et al., 2014). Em geral, a composição da biomassa lignocelulósica depende muito de sua fonte (derivada da madeira, madeira ou gramíneas), do cultivo e do clima (RAJENDRAN et al., 2018). A biomassa lignocelulósica é rica em carboidratos que estão presentes como polímeros (ALMEIDA; NASCIMENTO, 2021). A composição estrutural da biomassa consiste em uma intrínseca associação de polímeros complexos, carboidratos, proteínas, sais minerais e compostos fenólicos (DOMÍNGUEZ et al., 2017; KRASZNAI et al., 2018; MACHINENI, 2019). Considerando essa constituição, cerca de 90% da biomassa seca é composta por polímeros complexos dispostas em uma estrutura de matriz tridimensional não uniforme, tais como celulose, hemicelulose e lignina, observados na Figura 3. Os 10% restantes da biomassa seca são representados por compostos extrativos e minerais (CHEN; LEE, 2018; LAMOUNIER et al., 2020). A hemicelulose e a celulose são polissacarídeos que podem ser hidrolisados em açúcar, se tornando então passíveis de fermentação para obtenção de etanol (ALMEIDA; NASCIMENTO, 2021). 25 Fonte: Melendez et al. (adaptado), 2022 Figura 3. Estrutura complexa da biomassa lignocelulósica A celulose é um polímero altamente estável constituído de monômeros de glicose ligados por meio de cadeias lineares, composto principalmente de unidades (1,4)-D- glicopiranose que são ligadas por ligações β-1,4 (KRASZNAI et al., 2018; MACHINENI, 2019). Este polímero é estabilizado por ligações de hidrogênio intermolecular entre os grupos hidroxilas das cadeias de celulose e apresentam uma forte tendência em formar ligações de hidrogênio intramolecular (BINOD et al., 2019; UMMALYMA et al., 2019). Devido a essas interações, a celulose é um componente estrutural importante para as paredes celulares, sendo responsável pela força mecânica das plantas (ALEXANDRIDIS et al., 2018; SJULANDER; KIKAS, 2020). A solubilidade do polímero de celulose ocorre pela quebra simultânea da maioria das ligações glicosídicas, todavia, em temperaturas amenas, a celulose é insolúvel, tanto em água quanto em solventes orgânicos comuns. 26 A hemicelulose é o segundo heteropolissacarídeo mais abundante da biomassa vegetal (PEREIRA, et al., 2021). Na sua composição há presença de açúcares e ácidos orgânicos, que variam de acordo com as características individuais das plantas (HOUFANI et al., 2020; MACHINENI, 2019), e compostos açucarados, como as pentoses (D-xilose, L- arabinose) e as hexoses (D-glicose, D-manose e D-galactose) (SILVA, 2019; SJULANDER; KIKAS, 2020). A hemicelulose pode ser catalogada como manana (unidades de β-1,4-D- manose ligadas), galactana (unidades de β-1,3-D-galactose ligadas), arabinana (unidades de α- 1,5-arabinose ligadas) e xilana (unidades de β-1,4-D-xilose ligadas) (HOUFANI et al., 2020; MATOS, 2017). Entre os componentes da biomassa, a hemicelulose é o mais fácil de hidrolisar, pois esse heteropolissacarídeo não apresenta alta cristalinidade, o que torna sua estrutura mais suscetível à etapa de hidrólise (MACHINENI, 2019). A lignina é um polímero heterogêneo, complexo, amorfo, de cadeia longa e ramificado, constituída principalmente por grupos aromáticos e alifáticos (CHEN; WAN, 2017; YOO et al., 2020). A lignina atua como uma cola que preenche vazios entre a celulose e hemicelulose, promovendo resistência a impactos e compressão, e ainda, impermeabilidade da parede celular das plantas (GORDOBIL et al., 2016; YOO et al., 2020). A despolimerização da lignina é uma tarefa desafiadora, devido à sua estrutura altamente complexa e estável (GOVIL et al., 2020), sendo então, o principal obstáculo para o uso da biomassa lignocelulósica na conversão em etanol (HOUFANI et al., 2020; WANG et al., 2019). A conversão da biomassa lignocelulósica em bioetanol requer diferentes estágios, como pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação (PEREIRA, et al., 2021). A viabilidade econômica e consolidação do bioetanol lignocelulósico tem como requisito indispensável o emprego de todos os polissacarídeos presentes na constituição da matéria-prima lignocelulósica (TOOR et al., 2020). Na bioconversão da biomassa em etanol, o pré-tratamento garante a desconstrução desse material em açúcares fermentescíveis, sendo considerado a etapa mais onerosa de todo o processo fermentativo (SADHUKHAN et al., 2019; VALLADARES-DIESTRA et al., 2020). Nas últimas décadas, as metodologias utilizadas na dissociação dos monômeros fermentescíveis leva em consideração a estrutura da lignina, pois sua remoção aumenta a área superficial interna o que, consequentemente, permite o maior acesso das enzimas hidrolíticas a celulose (NANDAL; SHARMA; ARORA, 2020). A redução do tamanho das partículas da biomassa lignocelulósica, a expansão da área superficial e a dissolução da hemicelulose são os resultados esperados da etapa de pré-tratamento e dependem da metodologia utilizada (REZANIA et al., 2020). As metodologias podem ser concretizadas por métodos químicos, 27 físicos, físico-químicos, biológicos e a combinação destes (SADHUKHAN et al., 2019; VALLADARES-DIESTRA et al., 2020). A biomassa lignocelulósica quando submetida a etapa de pré-tratamento libera vários açúcares passiveis de fermentação, tais como, D-xilose, L-arabinose, D-manose, D- glicose, D-galactose (AYODELE; ALSAFFAR; MUSTAPA, 2020). Neste contexto, o rendimento obtido do bioetanol dependerá das condições operacionais ideais, principalmente da escolha de uma técnica eficiente na etapa de pré-tratamento (COOPER et al., 2020; MOOD et al., 2013). No entanto, nenhum protocolo de pré-tratamento já existente é adequado para atender a variedade de biomassa disponível, pois, as tecnologias aplicadas geralmente são combinações de vários métodos, que visam compensações para obter o máximo de açúcares com geração mínima de inibidores (NANDAL; SHARMA; ARORA et al., 2020). O pré-tratamento quimico utilizando ácido diluído é um método amplamente aplicado nos bioprocessos para a produção de etanol, por apresentar baixo custo, alta viabilidade econômica, alto rendimento de açúcar e ter êxito em todos os tipos de biomassa vegetal (CANDIDO; MORI; GONÇALVES, 2019; VERMA; SHASTRI, 2020). A hidrólise ácida da biomassa é baseada na formação de ácidos conjugados para catalisar a divisão das ligações glicosídicas com a adição de moléculas de água e a subsequente liberação de íons de hidrogênio (ZHENG et al., 2021). De acordo com Rezania et al. (2020), durante esse procedimento, a biomassa lignocelulósica também sofre uma ruptura na matriz estrutural e a hemicelulose é efetivamente degradada. Esses autores relatam também, que a utilização do ácido diluído oferece menor consumo do reagente em comparação com o procedimento com ácido concentrado, no entanto, necessita uma maior temperatura para atingir a eficiência e rendimento similar. De forma geral, a hidrólise ácida é realizada utilizando-se ácido sulfúrico (H2SO4) ou clorídrico (HCl) em concentrações entre 30% e 70% e temperatura menor que 100°C ou em concentrações entre 0,1% a 10% e temperatura entre 100°C e 250°C (RAJENDRAN et al., 2018). O principal propósito do tratamento ácido é solubilizar a fração hemicelulósica e sob certas condições se obtém alta recuperação da hemicelulose (85 a 95%) (RAJENDRAN et al., 2018). Sadhukhan et al. (2019) reportam que o rendimento teórico de bioetanol usando esse tipo de pré-tratamento, seguido de hidrólise enzimática é cerca de 76%. 28 3.4 Compostos inibidores do processo fermentativo A comercialização do bioetanol lignocelulósico pode ser comprometida pela etapa de pré-tratamento por ser capaz de produzir vários compostos inibidores celulares, os quais, podem exercer efeito negativo na etapa de fermentação da produção do bioetanol lignocelulósico (JÖNSSON; MARTÍN, 2016; LIU et al., 2020). Singh et al. (2018) relatam que aproximadamente 60 compostos químicos são formados e foram identificados como inibidores da fermentação no hidrolisado lignocelulósicos. Os compostos inibidores celulares são organizados em torno de três grupos principais, sendo estes, os derivados furanos (o furfural e o 5-hidroximetilfurfural), os ácidos alifáticos (o ácido acético, ácido fórmico e ácido levulínico) e os compostos fenólicos, que estão representados na Figura 4 (CANDIDO; MORI; GONÇALVES, 2019; LI et al., 2019). Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2022) com base em SJULANDER (2020). Figura 4. Esquema dos principais inibidores gerados a partir do tratamento ácido do material lignocelulósico De acordo com Matos (2017), o furfural e o 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) são os inibidores, encontrados no hidrolisado ácido de torta de girassol, que podem causar maiores 29 danos aos micro-organismos. A Figura 5 resume de forma ilustrativa os efeitos dos inibidores à célula leveduriforme. Legenda: (1) Danos à membrana do vacúolo; (2) Afeta a ação da citrocromo oxidase interferindo na respiração mitocondrial; (3) Afetam enzimas da via glicolítica e da via de conversão do bioetanol; (4) Aumentam a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs); (5) Degradação do DNA; (6) Diminuição do pH intracelular por meio do acúmulo de espécies aniônicas; (7) Degradação da membrana celular. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 Figura 5. Efeitos inibitórios dos derivados de furano, ácidos alifáticos, compostos fenólicos para a célula leveduriforme. De acordo com Van der Pol et al. (2014), o furfural e o 5-HMF impossibilita o trabalho das enzimas desidrogenases, tais como a álcool desidrogenase, piruvato desidrogenase e a aldeído desidrogenase, importantes para a produção de etanol. além de bloquear a formação de biomassa celular (MATOS, 2017; HEMANSI et al., 2022). Esses compostos inibidores podem também, causar redução na disponibilidade de NADH e ATP, interferindo nas atividades microbianas e ainda são responsáveis por gerar espécies reativas de oxigênio, causando danos às membranas mitocondriais e vacúolos das células de levedura (SJULANDER; KIKAS, 2020; GENCTURK; ULGEN, 2022). O furfural e 5-hidroximetil furfural afetam, ainda ação da 30 citrocromo oxidase, interferindo na respiração mitocondrial. Esses fatores indicam que os compostos 5-HMF e furfural são potenciais inibidores de fermentação A hidrólise do grupo acetila presentes na fração hemicelulósica resulta em ácido acético, e os ácidos levulínico e fórmico são formados a partir da degradação do 5-HMF em condições severas de reação (RAJENDRAN et al., 2018). Esses ácidos prejudicam a atividade microbiana, podendo aumentar a fase lag do crescimento microbiano e diminuir no rendimento de etanol final (LUCARINI et al., 2017). A maioria dos ácidos alifáticos, por terem baixo peso molecular, podem se difundir através da membrana para o meio intracelular. Consequentemente, ao se dissociarem, o pH intracelular diminui, resultando no acúmulo de níveis tóxicos de espécies aniônicas que podem provocar lise celular (LIU et al., 2021) Os compostos fenólicos também reduzem a eficiência da fermentação, pois afetam o crescimento do micro-organismo (HEMANSI et al., 2022). A capacidade dos compostos de penetrar na membrana das células é considerada a principal razão da sua toxicidade aos micro- organismos. Os compostos fenólicos podem alterar a fluidez e a hidrofobicidade da membrana celular, resultando em danos na membrana e vazamento de componentes intracelulares. Outra teoria sobre o mecanismo de inibição dos compostos fenólicos é que sua presença pode aumentar a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), e a interação dessas espécies com proteínas e enzimas pode causar mutagênese no DNA e morte celular (LIU et al., 2021). 3.4 Torta de Girassol A biomassa proveniente do cultivo de girassol, Helianthus annuus L., pode ser considerada uma matéria-prima alternativa e atraente para a produção de combustíveis a ser utilizado no setor de transportes (MANMAI; UNPAPROM; RAMARAJ, 2020). O girassol é considerado uma das plantas oleaginosas mais importantes mundialmente e, consequentemente, durante seu processamento gera toneladas de resíduos sem destino ambientalmente correto (BRAZIL et al., 2019; FAO, 2020). A semente de girassol é rica em ácidos graxos e o óleo extraído é amplamente utilizado como fonte de produção de biodiesel, bem como adorno culinário (ANTONOPOULOU; VAYENAS; LYBERATOS, 2016). Um subproduto da extração de óleo do girassol é a torta de sua semente, que é gerada em torno de 3-7 toneladas de biomassa seca por hectare de cultivo de girassol (BRAZIL et al., 2019). O uso desse resíduo é uma opção para a produção de bioetanol de segunda geração, uma vez que essa biomassa é rica em celulose e hemicelulose. O uso dessa biomassa pode agregar valor à cadeia de produção de bioetanol, bem 31 como diminuir consideravelmente o impacto ambiental resultante do seu descarte impróprio no meio ambiente (MATOS, 2017). 3.5 Leveduras As leveduras são fungos unicelulares, pertencentes principalmente aos filos Basidiomycota e Ascomycota e cuja reprodução pode ser assexuada, por meio de fissão ou brotamento multilateral e polar, ou sexuada, por meio de ascósporos (MATOS, 2017; ALMEIDA; NASCIMENTO, 2021). Um dos desafios na obtenção de resultados mais eficientes na produção de bioetanol de segunda geração é o emprego de micro-organismos capazes de fermentar todos os açúcares livres (pentoses e hexoses) disponíveis nos hidrolisados. A levedura Saccharomyces cerevisiae, considerada o micro-organismo referência no processo industrial de produção de etanol, não utiliza eficientemente as pentoses disponíveis nos hidrolisados lignocelulósicos, sendo necessário a busca por espécies capazes de realizar essa bioconversão (NANDAL; SHARMA; ARORA, 2020). Ao longo dos anos, vários estudos abordaram sobre diferentes micro- organismos capazes de converter pentoses a etanol, tais como bactérias, fungos filamentos e leveduras (BARBOSA, 2017; CADETE et al., 2016; LI et al., 2019; MARTINS et al., 2018; VALINHAS et al., 2018). Contudo, os estudos ainda não desenvolveram um micro-organismo com características ideais para o processo de conversão da pentose a bioetanol, em altos rendimentos (MARTINS et al., 2018). 3.6 Leveduras Fermentadoras de Pentose A Figura 6 apresenta as vias metabólicas envolvidas no consumo de açúcares de 5 carbonos (xilose e arabinose) e 6 carbonos (glicose) pela célula leveduriforme. A assimilação dos carboidratos pela levedura pode ser utilizada para crescimento celular, bem como para oxidação, resultando em etanol e dióxido de carbono, em condições anaeróbicas (LEE et al., 2021). A Glicólise, denominada também de via de Embden-Meyerhof, é uma rota catabólica no qual uma molécula de glicose é catalisada por uma sequência de reações oxidativas no citoplasma da levedura, formando duas moléculas de piruvato (MATOS, 2017). A conversão da glicose em duas moléculas de piruvato ocorre em duas fases: a fase preparatória, no qual são consumidos dois ATPs, e a fase de pagamento, onde são produzidos quatro ATPs. O rendimento líquido para cada molécula de glicose convertida a piruvato é, portanto, de dois ATPs. O piruvato pode ser oxidado pelo Ciclo de Krebs e adentrando a cadeia respiratória ou 32 pode ser convertido a etanol, através da ação das enzimas piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 6. Conversão dos monossacarídeos provenientes da fração hemicelulósica na célula leveduriforme A fermentação de pentoses possui adversidades, diferente da eficiente fermentação da glicose. Diversas espécies leveduriformes são capazes de metabolizar a xilose e a arabinose, porém, a capacidade de fermentar esses carboidratos em etanol não é frequente, cerca de 1% apenas das leveduras possuem essa característica (ALMEIDA; NASCIMENTO, 2021). As leveduras convertem xilose a etanol por meio da via metabólica das pentoses-fosfato. Na primeira etapa, a xilose é convertida a xilitol pela enzima xilose redutase (XR), a qual utiliza NADPH como cofator. A oxidação do xilitol à xilulose é catalisada pela enzima xilitol desidrogenase (XDH), dependente de NAD+ como cofator. Posteriormente, a D-xilulose é fosforilada pela enzima xilulocinase (XK), formando a D-xilulose-5-fosfato. Esse composto adentra a via pentose-fosfato, podendo ser convertido a frutose-6-fosfato e/ou gliceraldeído-3- fosfato, que são intermediários comuns da via glicolítica (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017) A L-arabinose é a segunda pentose de maior expressividade na hemicelulose e seu processo de assimilação da L-arabinose também ocorre através da via metabólica das pentoses- fosfato. O carboidrato passa por etapas precedentes de oxi-redução nas quais a L-arabinose é oxidada a L-arabitol pela enzima L-arabinose redutase (AR) e, posteriormente, é convertida a L-xilulose pela ação de redução da enzima L-arabinitol 4-desidrogenase (LAD). Em seguida, a 33 L-xilulose é oxidada a xilitol pela L-xilulose redutase (LXR), iniciando então a via da pentose- fosfato (CAMPOS, 2015; VALINHAS, 2016). As espécies de leveduras Candida shehatae, Scheffersomyces (Pichia) stipitis e Pachysolen tannophilus são as mais conhecidas no que diz respeito a fermentação de pentoses (VALINHAS, 2016). Nos últimos anos, a Scheffersomyces (Pichia) stipitis tem sido mencionada como uma das linhagens que apresenta a maior habilidade de fermentar xilose a etanol com altas taxas de rendimento (RUCHALA et al., 2020), em torno de 0,44 g g-1(VIEIRA, 2016). Essa levedura, além de utilizar a xilose, tem a capacidade de usar todos os principais açúcares provenientes do material lignocelulósico (PHAM et al., 2020). Todavia, apresenta baixa tolerância ao etanol e não é capaz de crescer em condições de anaerobiose, fato que se compõe como um dos gargalos da cadeia de produção do etanol lignocelulósico (RUCHALA et al., 2020). A Spathaspora passalidarum, outra espécie de levedura estudada nos últimos anos, consegue converter xilose a etanol em rendimentos entre 0,37 e 0,43 getanol gxilose-1 (CADETE et al., 2016; NEITZEL et al., 2020). A introdução de genomas de leveduras fermentadoras de pentoses na espécie Saccharomyces cerevisiae é uma tentativa de se obter um micro-organismo capaz de assimilar todos os açúcares e aumentar o rendimento na produção de etanol (HE et al., 2022; SANTOS, 2017). Estudos utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae recombinante reporta altas taxas de crescimento empregando apenas xilose como substrato (PEREIRA, 2020). Contudo, essa conversão gera como produto principal o xilitol, sendo o etanol produzido em baixos rendimentos, em torno de 0,36 g g-1 (SALES, 2015). A busca por micro-organismos robustos capazes de fermentar eficientemente todos os açúcares existentes na biomassa avança progressivamente, contudo para a consolidação da produção de etanol 2G seja uma realidade, são necessários vários estudos sobre um micro- organismo ideal capaz de converter pentose e hexose em etanol, mesmo na presença de inibidores e altas concentrações de etanol. A levedura Candida akabanensis UFVJM-R131, pertencente ao filo Ascomycota, geralmente encontrada em plantas ou excrementos de animais, demonstrou potencial para produção de etanol a partir de açúcares de 5 carbonos (JAMES et al., 2013). Valinhas et al. (2018) realizou ensaios com essa linhagem que obteve um rendimento de 0,34 getanol gxilose-1, eficiência fermentativa de 66,7% e produtividade volumétrica de 0,07 g L-1 h-1 em meio sintético contendo como substrato apenas xilose, na concentração de 20 g L-1. Matos (2017) realizou um estudo com essa mesma linhagem em hidrolisado ácido hemicelulósico proveniente de torta de semente de girassol. Nesse estudo, o micro-organismo demonstrou eficiência na 34 produção etanol, mesmo em presença dos inibidores fermentativos, tais como o ácido acético (5,27 g L-1), o furfural (0,05 g L-1) e o 5-hidroximetilfurfural (0,71 g L-1). A linhagem C. akabanensis UFVJM-R131 obteve uma eficiência de fermentação alcóolica de 52,19%, produtividade volumétrica de etanol de 0,21 g L-1 h-1 e rendimento de conversão dos açúcares a álcool de 0,27 g g-1. A glicose e xilose presente no hidrolisado hemicelulósico, foram convertidas em etanol pelas levedura e essa ainda, conseguiu assimilar a arabinose e glicerol também presentes nesse hidrolisado. Nesse estudo, os compostos inibidores presentes no meio fermentativo foram também consumidos pela levedura, indicando promissora linhagem para o processo industrial de produção de etanol. De acordo com Matos (2017), esses resultados obtidos, são capazes de impulsionar novas pesquisas nas áreas de fisiologia, bioquímica e genética dessas linhagens, bem como incentivar na otimização do processo fermentativo em busca de melhores condições de produção de bioetanol, uma vez que esse estudo, não foi desenvolvido em condições de otimização. De acordo com Barbosa (2017), a levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G, quando cultivada na proporção de 2:3 de glicose e xilose, obtém um rendimento de 0,19 g g-1, produtividade volumétrica de etanol de 0,09 gL-1h-1. A Candida orthopsilosis UFVJM-4G nessas condições, foi capaz ainda, de consumir 98,87% da xilose disponível, sendo este o melhor resultado dentro das linhagens estudadas, Galactomyces geotrichum (UFVJM-R10), Galactomyces geotrichum (UFVJM-R150), Rhodotorula mucilaginosa (UFVJM-2G) Rhodotorula mucilaginosa (UFVJM-8G), Candida orthopsilosis UFVJM-4G e Sporothrix sp. (UFVJM-5G) (BARBOSA, 2017). As espécies de leveduras Candida akabanensis e Candida orthopsilosis demonstram um potencial promissor para a produção de etanol a partir da fermentação de pentoses, contudo existe pouco estudo sobre o emprego desses micro-organismos na fermentação alcoólica de hidrolisado hemicelulósico (MATOS, 2017). 3.7 Adaptação celular O pré-tratamento é uma etapa essencial no processo de produção de bioetanol de segunda geração, por desestruturar a biomassa lignocelulósica em açúcares simples, tais como pentoses e hexoses, passiveis de sofrerem conversão em etanol (AYODELE; ALSAFFAR; MUSTAPA, 2020; RAJENDRAN et al., 2018). As altas temperaturas e compostos químicos empregados nessa etapa, pode desencadear reações secundárias e produzir subprodutos capazes de interferir na integridade celular das leveduras e assim, inibir os processos bioquímicos importante para a produção do etanol (KO et al., 2020; SANTOS, 2012). Ao longo dos anos, 35 os pesquisadores vêm estudando algumas estratégias capazes de minimizar os efeitos inibitórios das substâncias formadas na etapa de pré-tratamento, afim de aumentar o rendimento em etanol, tal como a aclimatação (ROQUE et al., 2019). A adaptação ou aclimatação de micro-organismos fermentativos em hidrolisados é uma estratégia interessante a ser empregada nos processos de produção de bioetanol de segunda geração, devido ao seu baixo custo (ACHINAS; EUVERINK, 2016; OPALEK; WLOCH- SALAMON, 2020; PRATTO, 2019), bem como a alta adaptação a natureza tóxica do hidrolisado após o pré-tratamento (RUCHALA et al., 2020; SMITH; RENSBURG; GÖRGENS, 2014). A aclimatação de micro-organismos em cultivos tóxicos provoca um estresse nas células microbianas, que pode proporcionar aos agentes fermentativos modificação seletiva de características genotípicas relevantes ao processo industrial, através da maleabilidade dos genomas (KO et al., 2020; MANS; DARAN; PRONK, 2018). A modificação seletiva pode proporcionar ao agente fermentativo a tolerância aos inibidores, a tolerância ao etanol, a estabilidade frente altas temperaturas, bem como o pH (OPALEK; WLOCH- SALAMON, 2020; TURANLI-YILDIZ et al., 2017). A aclimatação celular também pode interferir no crescimento celular. Segundo Morales et al. (2017), a espécie de levedura Spathaspora passalidarum passou por um processo de adaptação que foi realizado da seguinte maneira: (i) uma suspensão microbianda foi expostas à luz UV por 480 s; (ii) em seguida, essa suspensão foi inoculada em meio sólido contendo 1 g L-1 de ácido acético por 72h; (iii) a colônia foi transferida para meio líquido contendo 1 g L-1 de ácido acético por 7 h e (iii) as células foram inoculadas em biorreator com ciclo de taxas de diluições, onde as concentrações de ácido acético foram aumentadas gradualmente. Após o processo de adaptação, as células foram inoculadas em meio fermentativo com auto-hidrolisado de Eucalyptus globulus. As células nativas apresentaram rendimento de 0.22 g g-1 de etanol e produtividade volumétrica de 0,03 g L-1 h-1 e as células adaptadas foram capazes de produzir 0,36 g g-1 de etanol, com produtividade volumétrica de 0,55 g L-1 h-1. Vieira (2016) afirmou que a Spathaspora passalidarum se destacou nos experimentos de engenharia evolutiva em relação a outras leveduras fermentadoras de pentoses, como Scheffersomyces stipitis, Candida shehatae e Pachysolen tannophilus. A técnica utilizada para adaptação da levedura foi (i) inocular inicialmente o micro-organismo em meios contendo apenas hexoses como fonte de carbono, que foram substituídas pelas pentoses gradualmente, (ii) substituir a fonte de pentoses pelo hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, (iii) inocular as cepas em meio composto por melaço e hidrolisado. Esse autor reportou ainda 36 que a espécie S. passalidarum nativa, quando cultivada em meio sintético, apresentou rendimentos de 0,31 g g-1 de etanol e produtividade volumétrica de 0,08 g L-1 h-1 e após o processo de adaptação foi capaz de produzir 0,50 g g-1 de etanol por xilose consumida, com produtividade volumétrica de 0,11 g L-1 h-1. De acordo com Oliveira (2010), a linhagem de levedura Scheffersomyces (Pichia) stipitis em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, na presença de inibidores com concentrações de até 18 g L-1 de ácido acético, 900 mg L-1 de furfural e 300 mg L-1 de 5-HMF, foi capaz de produzir etanol com rendimento de 0,29 g g-1 e produtividade volumétrica de produção de etanol de 0,71 g L-1 h-1. Esse autor ainda relata que após o processo de aclimatações sucessiva (50 repiques), essa levedura foi capaz de melhorar seu rendimento de produção de etanol para 0,45 g g-1 e produtividade volumétrica para 0,84 g L-1 h-1 e diminuir o tempo de fermentação de 40h para 32h. Segundo Nigam (2001), a espécie de levedura Scheffersomyces (Pichia) stipitis adaptada em hidrolisado ácido de madeira macia possui um rendimento de etanol de 0,4 g g-1 e 0,1 g L-1 h-1 de produtividade volumétrica enquanto a linhagem parental apresenta resultados de 0,25 g g-1 e 0,21 g L-1 h-1. O processo de adaptação foi realizado durante seis semanas, por meio de repiques sucessivos utilizando como meio fermentativo o hidrolisado. Os autores Du et al. (2022) conduziram uma adaptação evolutiva da levedura Kluyveromyces marxianus na presença de múltiplos inibidores. As células foram incubadas em meio YPD com múltiplos inibidores com concentrações de 0,2 g/L de ácido fórmico, 0,5 g/L de ácido acético, 0,3 g/L de furfural e 0,2 g/L de 5-HMF. Quando a densidade óptica da suspensão atingiu 2,0, as células foram coletadas e transferidas para uma concentração mais alta de inibidores. As etapas foram repetidas até que a concentração final de inibidores fosse de 0,8 g L-1 de ácido fórmico, 1,2 g L-1 de ácido acético, 0,8 g L-1 de furfural e 0,6 g L-1 de 5-HMF. Ao fermentar hidrolisado de palha de milho, a levedura K. marxianus adaptada obteve um rendimento de etanol de 0,46 g g-1 (90% do valor teórico) do que a cepa mãe, que obteve rendimento de 0,41 g g-1 (DU et al., 2022). A Tabela 1 resume todas as informações supracitadas sobre a melhoria das células pós adaptação seletiva. Diante desses resultados, é notório o melhoramento da capacidade das leveduras em converter os açúcares encontrados no hidrolisado lignocelulósico a etanol, mesmo em altas concentrações de inibidores, bem como obter o álcool em tempo de fermentação inferior. A adaptação seletiva de leveduras é uma ferramenta extremamente poderosa para melhorar a fermentação dos açucares presente em hidrolisados lignocelulósicos em etanol (KO et al., 2020; LI et al., 2018; TURANLI-YILDIZ et al., 2017), bem como contribuir para melhorias nas 37 características genotípicas que podem resultar na resistência aos inibidores da biomassa hidrolisada (PEREIRA, 2020; SMITH; RENSBURG; GÖRGENS, 2014). Portanto, para se obter altos valores de bioetanol 2G pode-se aplicar esse método nos agentes fermentativos, proporcionando um aumento no rendimento de etanol, mesmo frente à inibidores (NOVY et al., 2017; OPALEK; WLOCH-SALAMON, 2020). Tabela 1. Adaptação de diferentes micro-organismos em diferentes hidrolisados visando a produção de bioetanol de segunda geração Micro-organismo Rendimento de etanol (getanol g- 1 açúcar) Meio de fermentação Referência Spathaspora passalidarum Não adaptada 0,31 g g -1 Hidrolisado de bagaço de cana-de- açúcar adicionado de melaço Vieira (2016) Adaptada 0,50 g g -1 Não adaptada 0,22 g g -1 Eucalyptus globulus Morales et al. (2017) Adaptada 0,36 g g -1 Scheffersomyces (Pichia) stipitis Não adaptada 0,29 g g -1 Hidrolisado de bagaço de cana-de- açúcar Oliveira (2010) Adaptada 0,45 g g+ Não adaptada 0,25 g g -1 Hidrolisado de madeira macia Nigam (2001) Adaptada 0,4 g g -1 Kluyceromyces marxianus Não adaptada 0,41 g g -1 Hidrolisado de palha de milho Du et al. (2022) Adaptada 0,46 g g -1 38 39 4 MATERIAL E MÉTODOS As etapas experimentais da presente dissertação foram executadas nos seguintes laboratórios: Laboratório de Bioprocessos e Biotransformação (LabBBio), Laboratório de Processamento de Biomassas Energéticas (LabPBio) e Laboratório de Microbiologia para Biocombustíveis (LabMBio) da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM), localizado no Campus JK, Diamantina-MG. A pesquisa foi organizada em seis etapas, representadas pela Figura 7,: 1) preparo da torta de girassol; 2) reativação, autenticação e manutenção dos micro-organismos; 3) obtenção e caracterização dos hidrolisados hemicelulósicos; 4) adaptação dos micro- organismos ao hidrolisado hemicelulósico (aclimatação); 5) processo fermentativo em hidrolisado hemicelulósico puro para fins comparativos e 6) monitoramento do processo fermentativo considerando o crescimento e viabilidade celular, consumo de açúcares e produção de etanol. 40 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 7. Fluxograma das etapas para adaptação celular das linhagens de leveduras Candida akabanensis UFVJM- R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G, utilizando hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol 41 4.1 Obtenção e extração do óleo da semente de girassol A semente de girassol (Helianthus annuus), da marca Pachá Alimentos, foi obtida no mercado local da cidade de Diamantina, Minas Gerais. A semente foi previamente triturada em liquidificador industrial e peneirada em peneira do tipo Tyler de mesh 14, com abertura de 1,18 mm. A extração do óleo da semente de girassol foi realizada através da utilização do solvente químico éter etílico P.A., para tanto essas foram trituradas a fim de aumentar a superfície de contato com o solvente e, em seguida, reservada em balão de fundo chato para posterior extração do óleo. A extração do óleo foi realizada pela adição de 500 mL de éter em 300 g de biomassa, com agitação manual ocasional. Após 2 horas de extração, a biomassa foi filtrada e adicionada de mais 500 mL do solvente, com agitação manual ocasional por mais 2 horas, seguida de filtração e secagem em estufa à 60°C até peso constante. O líquido recolhido foi submetido ao processo de destilação para recuperação do éter e do óleo. 4.2 Caracterização centesimal da biomassa desengordurada O farelo de semente de girassol foi submetido à caracterização química quanto aos teores de lipídios totais, umidade, cinzas totais (AOAC, 1992), fibras em detergente ácido (FDA), fibras em detergente neutro (FDN), celulose, hemicelulose, lignina (VAN SOEST, 1967; VAN SOEST; MOORE, 1966), açúcares solúveis totais e amido (McCREADY et al., 1950), descritas a seguir. 4.2.1 Preparo das amostras Uma amostra de 100 g do farelo de girassol, produto da extração do óleo das sementes, foi reservada para as determinações analíticas descritas a seguir. 4.2.2 Determinação da umidade Uma quantidade de 3,0 g de amostra foi transferida para placas de Petri previamente desumidificadas (105°C por 1 hora) e com pesos conhecidos. As placas contendo as amostras foram mantidas em estufa a 105°C, até peso constante. O teor de umidade foi calculado segundo a Equação 1 abaixo e expresso em g 100 g-1 de matéria seca. As determinações foram realizadas em triplicadas para cálculo de média e desvio padrão. 𝑈% = 𝑚𝑎𝑢 − 𝑚𝑎𝑠𝑚𝑎𝑢 𝑥100 Equação 1 42 Onde: 𝑈% = teor de umidade, em porcentagem; 𝑚𝑎𝑢= massa da amostra úmida (g); 𝑚𝑎𝑠= massa da amostra seca (g). 4.2.3 Determinação do teor de cinzas Uma amostra de 0,5 g foi transferida para cadinhos de porcelana previamente calcinados em mufla a 550ºC e com pesos conhecidos. As amostras foram calcinadas em mufla a 550ºC por 5 horas e logo após resfriadas em dessecador e pesadas. Os resultados foram expressos em g 100 g-1 de matéria seca. As determinações foram realizadas em triplicadas para cálculo de média e desvio-padrão. Os cálculos foram feitos segundo a Equação 2. 𝐶% = 𝑚𝑐𝑐 − 𝑚𝑐𝑣𝑚𝑎 𝑥100 Equação 2 Onde: 𝐶% = teor de cinzas, em porcentagem; 𝑚𝑐𝑐= massa do cadinho contendo as cinzas (g); 𝑚𝑐𝑣= massa do cadinho vazio (g); 𝑚𝑎= massa da amostra (g). 4.2.4 Determinação dos lipídios remanescentes A determinação do teor de lipídios foi realizada a partir de 2,0 g de farelo de girassol previamente triturado e transferido para cartucho de papel filtro qualitativo com porosidade de 12,5 μm. O cartucho contendo a amostra foi colocado na câmara do extrator tipo Soxhlet (TECNAL) acoplado a um balão de fundo chato de 500 mL, previamente desumidificado a 105 °C por 1h e pesado. A extração foi conduzida por aproximadamente 5 horas utilizando o éter etílico como solvente extrator. Após a extração, os balões contendo os lipídeos foram submetidos à secagem a 105°C por aproximadamente 1 h, a fim de evaporar o solvente remanescente. Na sequência, os balões foram resfriados até temperatura ambiente em dessecador e pesados em balança analítica. Os resultados foram expressos em gramas de lipídios por 100 g de biomassa lignocelulósica desumidificada e posteriormente convertido em porcentagem de lipídios conforme a Equação 08. 𝐿𝐼𝑃% = (𝑚𝑖 − 𝑚𝑓)𝑚𝑎 × 100 Equação 3 43 Onde: 𝐿𝐼𝑃% =teor de lipídio, em porcentagem; 𝑚𝑖= massa (g) do cartucho com a amostra antes da extração; 𝑚𝑓= massa (g) do cartucho com a amostra depois da extração 𝑚𝑎 = massa (g) da amostra inicial. 4.2.5 Determinação de Proteínas Totais A determinação de proteínas totais foi realizada a partir da transferência de 0,5 g de amostra para tubos de digestão de 25 x 250 mm onde se adicionou 600 mg de sulfato de potássio, 300 mg de sulfato de cobre e 10 mL de ácido sulfúrico concentrado. A mistura foi aquecida a 350°C por 3 horas em bloco digestor da marca Tecnal, até completa mineralização do nitrogênio orgânico, o que é percebido pela limpidez que se estabelece no meio reacional. Na sequência, os tubos contendo o material digerido foram transferidos para o destilador de nitrogênio, onde se adicionou cerca de 15 mL de NaOH 50%. O destilado foi recuperado em frascos cônicos de 250 mL contendo 15 mL de solução saturada de ácido bórico e 3 gotas de solução indicadora de vermelho de metila a 0,1%. Posteriormente, o destilado foi titulado com ácido clorídrico padronizado 0,02 N. Os resultados foram expressos em g de proteínas por 100 g de matéria seca (50°C), calculados segundo a Equação 4. As determinações foram realizadas em triplicadas para cálculo de média e desvio-padrão. PROT% = 𝑉𝐻𝐶𝑙×𝑁𝐻𝐶𝑙×14×6,25𝑚𝑎 × 100 Equação 4 Onde: 𝑃𝑅𝑂𝑇% =teor de proteínas, em porcentagem; 𝑉𝐻𝐶𝑙= volume gasto de HCl na titulação (mL); 𝑁𝐻𝐶𝑙= Normalidade da solução de HCl; 𝑚𝑎 = massa da amostra inicial (mg); 14= número de massa atômica do nitrogênio; 6,25= Fator de conversão para nitrogênio protéico. 4.2.6 Determinação de Fibra em Detergente Ácido (FDA) A solução de Detergente Ácido foi feita adicionando 10g de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) a 500 mL de H2SO4 1,0N (0,5 mol/L) previamente padronizado. A solução foi aquecida e agitada para melhor dissolução dos componentes. 44 Uma amostra de 0,25 g foi transferida para tubos de digestão de 25 x 250 mm juntamente com 25 mL da solução de detergente ácido, em triplicata. As amostras contidas nos tubos foram digeridas em bloco digestor por 60 minutos a 110°C. Em seguida o material foi filtrado em cadinhos filtrantes de vidro sinterizado (cadinhos de Gooch) previamente desumidificados (105°C por 1 hora) e com peso conhecido. As amostras foram lavadas com água destilada quente (95±1°C) até não se observar mais a formação de espuma e, depois de escoada toda a água, com mais 30 mL acetona para retirada total do detergente e lipídeos. Os filtros foram submetidos à secagem em estufa a 105°C até peso constante e o teor de fibras em detergente ácido foi expresso em gramas de FDA 100 g-1 de matéria seca e calculado utilizando a Equação 5. As determinações foram realizadas em triplicadas para cálculo de média e desvio- padrão. 𝐹𝐷𝐴% = (𝑚𝑓𝑟 − 𝑚𝑓𝑣)𝑚𝑎 × 100 Equação 5 Onde: 𝐹𝐷𝐴% =teor de fibra em detergente ácido, em porcentagem; 𝑚𝑓𝑟= massa do filtro com resíduo (g); 𝑚𝑓𝑣= massa do filtro vazio (g); 𝑚𝑎 = massa da amostra inicial (g). 4.2.7 Determinação de Fibra em Detergente Neutro (FDN) A solução de Detergente Ácido foi feita adicionando 15g de dodecil sulfato de sódio (USP), 9,305 g de sal dissódico etilenodiaminotetraacético (desidratado), 3,405 g de borato de sódio, 2,28 g de fosfato de sódio dibásico (anidro) e 5,0 mL de trietilenoglicol a 500 mL de H2O destilada. O pH foi aferido entre 6,9 e 7,1 e então, a solução foi aquecida e agitada para melhor dissolução dos seus componentes. Amostras de 0,25 g foram transferidas para tubos macros para bloco digestor de 25 x 250 mm e adicionadas de 0,25g de sulfito de sódio, 25 mL de solução de detergente neutro e 50 μL de alfa amilase termoestável comercial (Termamyl 120L). Em seguida as amostras contidas nos tubos foram submetidas à digestão em bloco digestor por 60 minutos a 110°C e logo depois se procedeu à filtração em cadinhos filtrantes de vidro sinterizado (cadinhos de Gooch, porosidade média a grossa de 100 a 160 µm), previamente desumidificados (105°C por 1 hora) e com peso conhecido. As amostras foram lavadas com água destilada quente (95±1°C) até não haver mais presença de espuma e, depois de escoada toda a água, lavada com mais 30 mL acetona para retirada total do detergente e lipídeos. Em seguida, os filtros foram submetidos 45 a secagem em estufa a 105°C até peso constante e o teor de fibras solúveis em detergente neutro expresso em gramas de FDN 100 g-1 de matéria seca (50°C), calculados usando a Equação 6. As determinações foram realizadas em triplicadas para cálculo de média e desvio-padrão. 𝐹𝐷𝑁% = (𝑚𝑓𝑟 − 𝑚𝑓𝑣)𝑚𝑎 × 100 Equação 6 Onde: 𝐹𝐷𝑁% =teor de fibra em detergente neutro, em porcentagem; 𝑚𝑓𝑟= massa do filtro com resíduo (g); 𝑚𝑓𝑣= massa do filtro vazio (g); 𝑚𝑎 = massa da amostra inicial (g). 4.2.8 Determinação da celulose (Cel) A determinação do teor de celulose foi realizada após a pesagem dos filtrados contidos nos filtros de Gooch provenientes da análise de FDA. Os filtrados foram adicionados de 30 mL de ácido sulfúrico 72% (p/p) sob vigorosa agitação com auxílio de um bastão de vidro. Após o escoamento lento e completo do ácido, os filtros foram lavados com água destilada quente (95±1°C) até que, através do uso do papel tornassol, se observasse a remoção de todo o ácido. Em seguida, os cadinhos contendo o filtrado foram submetidos à secagem em estufa a 105°C até peso constante, resfriados em dessecador e pesados. A massa de celulose foi dada pela diferença da massa do filtro de Gooch antes e depois da adição da solução de ácido sulfúrico a 72%. O resultado foi calculado de acordo com a Equação 7, descrita a seguir, e expresso em porcentagem de celulose em matéria seca. As determinações foram realizadas em triplicadas para cálculo de média e desvio-padrão. 𝐶𝑒𝑙% = (𝑚𝑖 − 𝑚𝑓)𝑚𝑎 × 100 Equação 7 Onde: 𝐿𝐷𝐴% =teor de lignina; 𝑚𝑖= massa do filtro com FDA antes da adição do ácido sulfúrico (g); 𝑚𝑓= massa do filtro com FDA depois da adição do ácido sulfúrico (g); 𝑚𝑎 = massa da amostra inicial (g). 4.2.9 Determinação de Lignina em Detergente Ácido (LDA) e Cinzas (CZ) O cálculo do teor de lignina foi realizado a partir das amostras remanescentes da análise de celulose. Após a completa calcinação do filtro de Gooch contendo a lignina e 46 minerais insolúveis em mufla a 550°C, os filtros foram resfriados em dessecador até temperatura ambiente. O teor de lignina foi calculado pela diferença entre a massa do filtro de Gooch antes da incineração e a massa do filtro de Gooch após incineração e resfriamento em dessecador. Os resultados foram calculados de acordo com a Equação 8 e expresso em porcentagem de cinzas na LDA. O teor de cinzas foi calculado pela diferença entre a massa do filtro de Gooch após a incineração e resfriamento em dessecador e a massa do filtro de Gooch vazio. Os resultados foram calculados de acordo com a Equação 9 e expresso em porcentagem de cinzas na LDA. As determinações foram realizadas em triplicadas para cálculo de média e desvio padrão. 𝐿𝑖𝑔% = (𝑚𝑖 − 𝑚𝑓)𝑚𝑎 × 100 Equação 8 Onde: LDA% =teor de lignina; CZ% =teor de cinzas; 𝑚𝑖= massa do filtro proveniente da análise de celulose (g); 𝑚𝑓= massa do filtro com resíduo inorgânico depois da incineração em mufla (g); 𝑚𝑓𝑣= massa do filtro vazio (g); 𝑚𝑎 = massa da amostra (g). 𝐶𝑍% = (𝑚𝑖 − 𝑚𝑓𝑣)𝑚𝑎 × 100 Equação 9 O cálculo da LDA livre de cinzas foi realizado pela subtração LDA% do teor de cinzas. 4.2.10 Determinação da hemicelulose O teor de hemicelulose foi determinado pela diferença entre o valor de FDN% e o valor de FDA%. Os resultados foram calculados de acordo com a Equação 10 e expresso em porcentagem de hemicelulose em matéria seca. As determinações foram realizadas em triplicadas para cálculo de média e desvio-padrão 𝐻𝑒𝑚% = 𝐹𝐷𝑁% − 𝐹𝐷𝐴% Equação 10 Onde: 𝐻𝑒𝑚% = teor de hemicelulose; 𝐹𝐷𝑁% = teor de FDN; 𝐹𝐷𝐴%= teor de FDA; 47 4.2.11 Determinação de Amido e Açúcares Solúveis Totais (AST) Os teores de amido e açúcares solúveis totais foram determinados segundo a metodologia adaptada de McCready (1950). Para tanto, em microtubos tipo Eppendorff de 2,0 mL, foram adicionados 0,20 g de amostra e 1,5 mL de álcool etílico a 80% (v/v) aquecido ao limite da ebulição (80°C) e mistura foi homogeneizada. A seguir procedeu-se a centrifugação a 4000 rpm por 10 minutos e a fração do sobrenadante transferida para balão volumétrico de 50 mL. O procedimento de lavagem do precipitado com etanol foi repetido por mais duas vezes. Os sobrenadantes recuperados foram avolumados para 50 mL que com água destilada e então, reservado para posterior quantificação de açúcares solúveis totais (AST). O teor de amido foi determinado a partir do precipitado remanescente contido no microtubo, no qual se adicionou 1,5 mL de ácido perclórico 30%, seguido de agitação em agitador tipo vortex por 2 (dois) minutos. Logo após, a reação foi mantida por 30 minutos, com agitação ocasional, para a hidrólise do amido, seguido de centrifugação a 4000 rpm por 10 minutos. O procedimento de hidrólise/extração do amido foi repetido por mais duas vezes. Os sobrenadantes de cada extração foram coletados e avolumados em balão volumétrico de 50 mL para posterior quantificação do amido. As quantificações de amido e do AST foram realizadas com solução de antrona a 0,2% preparada com solução de ácido sulfúrico 72% (v/v). O doseamento foi realizado em tubos de ensaio a partir da adição de 1 mL de cada amostra, previamente diluída, somada a 5 mL da solução de antrona. Os tubos foram incubados em banho de água fervente por 10 minutos, seguidos de resfriamento em banho de água com gelo e leitura de absorbância em espectrofotômetro a 620 nm. Solução padrão de glicose foi usada como referência para a quantificação dos açúcares. Os valores de amido foram obtidos multiplicando-se o teor de glicose pelo fator 0,90. 4.3 Preparo e caracterização do hidrolisado ácido de torta de girassol O processo de hidrólise química da torta de girassol foi realizado de acordo com as condições pré-estabelecidas em estudo anterior realizado pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Bioprocessos e Biotransformação (PPGBiocomb-UFVJM), conforme descritos a seguir. A hidrólise foi realizada com solução de ácido sulfúrico (H2SO4) na concentração 6% (m/v) e razão sólido-líquido (S/L) de 31%, seguida de aquecimento em autoclave vertical a 120°C, 1 atm, por 38 minutos (MATOS et al., 2018). Após está etapa foi realizada a filtração sob vácuo em papel de filtro de porosidade de 14µm. O hidrolisado recuperado foi neutralizado 48 com Ca(OH)2 P.A. e então, novamente, submetido a filtração para a remoção do CaSO4, produto da reação de neutralização. O hidrolisado obtido foi caracterizado quanto à concentração dos açúcares L- arabinose, D-xilose, D-glicose, bem como os teores de potenciais inibidores, ácido acético, furfural, 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) e ainda, do glicerol, por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com uso do sistema Shimadzu Prominence UPLC 20A, equipado com coluna Rezex ROA-Shodex ® (300 x 7.5 mm). Os açúcares foram detectados por índice de refração e os compostos 5-HMF, furfural e ácido acético foram detectados por UV (220 nm). Padrões externos foram usados para a identificação e quantificação dos compostos pesquisados. Os padrões utilizados para quantificação dos compostos se encontram na Tabela 2 e as condições operacionais empregadas para as análises encontram-se na Tabela 3. Tabela 2. Padrões utilizados na quantificação dos compostos químicos Padrões para quantificação dos compostos D-glicose 10 g L-1 D-xilose 10 g L-1 L-arabinose 10 g L-1 Glicerol 10 g L-1 Ácido acético 10 g L-1 Furfural 10 g L-1 5-Hidroximetilfurfural (5-HMF) 10 g L-1 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 Tabela 3. Condições operacionais empregadas na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para as análises de açúcares, ácido acético, furfural, 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) e glicerol, no hidrolisado ácido lignocelulósico Condições operacionais Eluente: H2SO4 0,0025 mol L-1 Vazão de fase móvel: 0,6 mL min -1 Volume de amostra (loop): 5 μL T externa (coluna): 60°C T interna (detector): 40°C Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. 49 As amostras para as análises cromatográficas foram preparadas pela adição de 700 µL de eluente a 300 µL de amostra, seguido de centrifugação a 4000 rpm por 10 minutos. Após a centrifugação 800 µL do sobrenadante foram coletados e transferidos para frascos de vidro para cromatografia com capacidade para 1 mL. 4.4 Reativação e manutenção dos micro-organismos As linhagens de leveduras Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G, isoladas do bagaço de cana-de-açúcar e arroz doce (Valinhas et al., 2018) e Barbosa (2017), fazem parte do acervo microbiano do laboratório de microbiologia para biocombustíveis da UFVJM. As referidas linhagens estão registradas no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen), sob número de cadastro A18446E. As leveduras encontravam-se conservadas sob congelamento a -18°C, em meio líquido Yeast extract-Malt-Peptone-Dextrose YMPD (3,0 g L-1 de extrato de levedura; 3,0 g L- 1 de extrato de malte; 5,0 g L-1 de peptona de soja e 10 g L-1 de glicose) acrescido de 10% (v/v) de glicerol, em microtubo tipo Eppendorf. A reativação foi realizada a partir do inóculo em estria simples feito com alça de inoculação com loop de 10 uL, em meio ágar YMPD (meio adicionado de 17 g L-1 de ágar). O cultivo foi incubado à 28°C em estufa microbiológica por 48h. A manutenção dos micro-organismos foi realizada pela técnica de repique tubo-a- tubo (Sola et al., 2012) em meio ágar YMPD nas mesmas condições de cultivo descritas para a reativação, item 4.4.1. 4.5 Autenticação dos micro-organismos fermentadores de pentose O processo de autenticação das linhagens Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G foi realizado por meio de ensaios morfológicos, macro e microscópicos (Figura 8) e comparados com as caraterísticas já descritas para essas leveduras. 50 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 8. Ensaios morfológicos para autenticação dos micro-organismos a) Ensaios morfológicos macroscópicos As análises macroscópicas foram realizadas a partir da observação das características visuais utilizando parâmetros, tais como: forma da colônia (circular ou irregular), tamanho (grande, médio ou pequeno), cor, superfície (estrias concêntricas, estrias radiais, vales radiais ou granulosa), tipo de borda (lisa, franjeada, ondulada, pragueada, crenada, lobulada ou filamentosa) e perfil (lisa, côncava, convexa, achatada, crateriforme) das culturas, seguindo o modelo da Tabela 4. Os parâmetros citados foram observados a partir da técnica de microgota de acordo com o descrito por Dias; Schwan (2010). Essa técnica foi feita a partir da retirada de uma alçada da cultura crescida em meio ágar YMPD, item 4.4, seguida da transferência para um microtubo tipo Eppendorf contendo 1 mL de água destilada estéril, para fins de esgotamento das reservas de energia. A cultura foi incubada a 28°C por 24h e logo depois realizado um inóculo central tipo microgota (5 µL da cultura), em duplicata. 51 Tabela 4 - Principais variações na morfologia de colônias de leveduras Superfície Borda Perfil Fonte: (DIAS; SCHWAN, 2010) ADAPTADO. As microgotas foram adicionadas em diferentes meios, descritos na Tabela 5, com o intuito de se observar o crescimento da colônia nos meios contendo diferentes composições. Foram utilizados meios contendo apenas glicose como fonte de carbono (YMPD), apenas xilose como fonte de carbono (YMPX) e sem nenhum tipo de fonte de carbono, como os meios ágar- ágar (AA) e ágar-acetato (AC). 52 Tabela 5. Meios de culturas utilizados para observar as características macro e microscópicas das linhagens Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G. Sigla Meio de cultivo Composição Referência YMPD Yeast extract-Malt- Peptone-Dextrose 3,0 g L-1 de extrato de levedura; 5,0 g L-1 de peptona de soja; 3,0 g L-1 de extrato de malte; 10 g L-1 de glicose e 17 g L-1 de ágar (DIAS; SCHWAN, 2010) YMPX Yeast extract-Malt- Peptone-Xylose 3,0 g L-1 de extrato de levedura; 5,0 g L-1 de peptona de soja; 3,0 g L-1 de extrato de malte; 10 g L-1 de xilose e 17 g L-1 de ágar AA Ágar-ágar 17 g L-1 de ágar AC Ágar-acetato 17 g L-1 de ágar e 5 g L-1 de acetato de sódio Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2022) com base em DIAS, SCHWAN (2010). b) Crescimento da colônia As culturas foram avaliadas quanto ao seu crescimento, após os ensaios morfológicos, sendo monitoradas a cada 24h em relação ao diâmetro da colônia, por um período de até 96 horas. c) Ensaios morfológicos microscópicos As análises microscópicas foram realizadas pela técnica de microcultivo (RIDDELL, 1950), utilizando câmara de microcultivo como representada na Figura 9. Para tanto, uma câmara de biocultivo, estéril, foi montada sendo esta composta por uma placa de placa de Petri contendo uma lâmina sobre um suporte de vidro, em U ou V, uma lamínula e um pequeno pedaço de algodão. Um pequeno bloco de meio sólido YMPD, YMPX, ágar-ágar (AA) e ágar-acetato (AC), foi transferido, com o auxílio de um bisturi estéril, para o centro da lâmina, onde, nos quatro cantos do bloco de meio procedeu-se o inóculo da colônia estudada. Logo após, o bloco de meio foi recoberto com uma lamínula estéril e um pedaço de algodão foi adicionado na câmara e mantido umedecido com água destilada estéril, de forma que a placa de Petri funcionasse como uma câmara úmida. O biocultivo foi incubado à 28°C e quando observado desenvolvimento satisfatório dos micro-organismos sua lamínula foi retirada e 53 utilizada para o preparo de uma nova lâmina para visualização microscópica. O Azul de metileno foi utilizado como corante para o processo de visualização microscópica. Fonte: BARBOSA, 2017. Figura 9. Representação esquemática de uma câmara de biocultivo ou microcultivo utilizada no preparo das lâminas para visualização microscopica das leveduras estudadas. As observações microscópicas foram realizadas em microscópio óptico (Bioval e Bel Photonic) utilizando as lentes objetivas de 40x e 100x. Características estruturais e reprodutivas dos micro-organismos foram observadas, tais como: tipo de reprodução (brotamento ou fissão), polaridade (unipolar, bipolar ou multipolar), formação de pseudohifa e hifa verdadeira, forma da célula (elipsóide, globosa ou cilíndrica) e presença de clamidósporo, conídeos, artroconídeos, ascos e ascósporos. As descrições abordadas por Dias; Schwan (2010) e Kurtzman et al. (2011) foram utilizadas como auxílio para na etapa de autenticação. O conteúdo da Tabela 6 compreende as características microscópicas observadas. O microcultivo foi realizado em diferentes meios, descritos na Tabela 5 supracitada, com o intuito de se observar as estruturas que a levedura é capaz de criar quando cultivada em meio contendo apenas glicose como fonte de carbono (YMPD), apenas xilose como fonte de carbono (YMPX) e sem nenhum tipo de fonte de carbono, como os meios ágar-ágar (AA) e ágar-acetato (AC). Esses dois últimos meios são considerados estressantes para a célula, possibilitando a observação de estruturas diferentes. 54 Tabela 6 - Representação esquemática das principais características da morfologia celular de leveduras (forma, reprodução e polaridade Representação em Esquema Forma Reprodução Polaridade Elipsóide Brotamento Multipolar (A) Bipolar (B) Globosa Brotamento Unipolar (A) Multipolar (B) Cilíndrica Fissão Bipolar (A) Unipolar (B) Apiculada Brotamento Unipolar Triangular Brotamento Unipolar (A) Multipolar (B) Talóide Esterigma Unipolar Globular com hifas Formação de hifas verdadeiras - Globular com pseudo-hifa Brotamento - Variadas Ascósporos - Fonte: (DIAS; SCHWAN, 2010) ADAPTADO 55 4.6 Curva de crescimento O perfil de crescimento das leveduras foi estudado através do processo fermentativo em meio liquido sintético YPMX preparado como descrito na Tabela 5. O processo fermentativo foi conduzido pelas linhagens C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G com inoculo na proporção de 10% do meio de acordo como descrito no item 4.6.1. O bioprocesso foi monitorado considerando o consumo de xilose. 4.6.1 Preparo do inóculo O inóculo das linhagens leveduriformes C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G foi realizado a partir da cultura reativada (Item 4.4). Uma alçada dessa cultura foi transferida para 30 mL de meio líquido YMPD contido em frasco Erlenmeyer de 50 mL e incubado a 28ºC sob agitação de 150 rpm (orbital-shaker) até atingir a medida de densidade óptica de 1,0 DO à 610 nm. Em seguida, a amostra foi homogeneizada, submetida à centrifugação a 4.000 rpm por 10 minutos e então, a biomassa microbiana foi recuperada e ressuspensa em meio fermentativo YPMD na proporção de 10% como anteriormente descrito. 4.6.2 Processo fermentativo O processo fermentativo foi realizado em frascos do tipo Erlenmeyer de 250 mL, contendo 100 mL do meio YPMX líquído. O meio fermentativo foi incubado em orbital-shaker, à 28°C sob agitação de 150 rpm. Alíquotas de 1 mL foram retiradas para realização nas análises descritas a seguir. 4.6.3 Monitoramento do processo O processo fermentativo foi monitorado a cada 2 horas quanto à viabilidade celular por meio de contagem de células em câmara de Neubauer, densidade óptica (DO), consumo de xilose através da determinação da concentração de açúcares redutores pelo método DNS, taxas de especifica de crescimento microbiano e tempo de geração. 4.6.3.1 Determinação da Densidade Óptica As medidas de Densidade Óptica foram avaliadas por espectrofotometria com leitura de absorbância a 610 nm. As análises foram feitas a partir de 0,5 mL de amostra, centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos. Em seguida as células foram lavadas, ressuspensas em água destilada, o sobrenadante descartado e o pellet (biomassa) celular recuperado. O pellet foi ressuspenso em água destilada estéril e submetido a leitura da absorbância. 56 4.6.3.2 Peso seco No final da fermentação com meio sintético, 30 mL do meio de cultivo foi separado para quantificação do peso seco. A biomassa celular formada foi centrifugada e ressuspensa em em água estéril. A suspensão microbiana foi dividida em 13 porções, no qual foram realizadas diluições de até 12x, cujo conteúdo final fosse de 10 mL. Cada solução foi medida por espectrofotometria com leitura de absorbância a 610 nm, para determinação da densidade óptica e, em seguida, colocado em placas de Petri, previamente pesadas. As placas foram levadas para estufa à 105°C até peso constante, sendo novamente pesadas. Os valores encontrados na diferença da pesagem da placa de Petri antes e depois do acondicionamento da suspensão celular das leveduras, foram utilizados para construção de uma reta que correlaciona densidade óptica e concentração (g L-1) da suspensão celular. 4.6.3.3 Análises em cromatrografia líquida O sobrenadante obtido de cada ponto foi caracterizado quanto à concentração dos açúcares L-arabinose, D-xilose, D-glicose, bem como os teores de potenciais inibidores, ácido acético, furfural, 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) e ainda, do etanol e glicerol, por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com uso do sistema Shimadzu Prominence UPLC 20A, equipado com coluna Rezex ROA-Shodex ® (300 x 7.5 mm). Os padrões utilizados para quantificação dos compostos e as condições operacionais empregadas para as análises se encontram na Tabela 2 e Tabela 3, citadas anteriormente. 4.6.3.4 Concentrações de açúcares redutores (AR) A quantificação de açúcares redutores nas análises foi determinada através do método colorimétrico com ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), descrito por Miller (1959) e adaptado segundo Vasconcelos, Pinto e Aragão (2013), no qual 100 µL do reagente DNS é adicionado à 100 µL da amostra, seguida de incubação em banho-maria a 70°C por 25 minutos, resfriamento em banho de água e gelo e leitura em espectrofotômetro com leitor de microplaca (Asys Tech) a 540 nm. O método baseia-se na redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3- amino-5-nitrosalicílico, de coloração amarronzada, ao mesmo tempo em que o grupo aldeído do açúcar é oxidado a grupos carboxílicos. Curvas analíticas utilizando xilose como padrão, com concentração variando de 0,0 a 1,0 g L-1, foram construídas e submetidas simultaneamente aos mesmos procedimentos que a amostra. Todas as determinações analíticas foram realizadas em triplicata. 57 4.6.3.4 Taxa específica de crescimento microbiano - µmáx A taxa específica de crescimento µmáx é diretamente proporcional à concentração X e será calculada de acordo com a Equação 11. In X𝑋0 = µ𝑚á𝑥 t Equação 11 Onde: µmáx = taxa específica de crescimento microbiano máximo (h-1); 𝑋= massa celular final (g L-1); 𝑋0= massa celular inicial (g L-1); 𝑡= duração da fase exponencial do crescimento celular (h). 4.6.3.5 Tempo de geração - tg O tempo de geração, ou seja, intervalo de tempo necessário para dobrar o valor da concentração celular (SCHMIDELL et al., 2001) foi calculado baseado na Equação 12. 𝑡𝑔 = ln (2)µ𝑚á𝑥 Equação 12 Onde: 𝑡𝑔= tempo de geração; µmáx = taxa específica de crescimento microbiano máximo (h-1); 4.6.3.6 Produção de biomassa total ΔX A produção total de biomassa após o processo fermentativo foi calculada com o auxílio da equação da reta criada através do experimento de peso seco, no qual relaciona a concentração de biomassa com a densidade óptica medida. Posteriormente, utilizou-se a Equação 13. ∆𝑋 = 𝑋𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑋𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 Equação 13 Onde: ∆𝑋= produção de biomassa total, durante o processo fermentativo (g L-1); 𝑋𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙= biomassa produzida ao final do processo fermentativo (g L-1); 𝑋𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙= biomassa encontrada no início do processo fermentativo (g L-1); 58 4.7 Adaptação/aclimatação celular das linhas C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G O procedimento para obtenção de linhagens aclimatadas foi realizado através do processo fermentativo das linhagens de leveduras em meios contendo diferentes concentrações de hidrolisado hemicelulósico. O processo de condução dessa etapa encontra-se esquematizado na Figura 10. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 Figura 10. Esquema do procedimento utilizado para aclimatação de células de leveduras C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G em hidrolisado ácido de torta de girassol. 59 4.7.1 Processo fermentativo de aclimatação As leveduras estudadas foram aclimatadas em meio fermentativo contendo o hidrolisado hemicelulósico nas concentrações de 25, 50, 75 e 100%, diluída em meio sintético. A proporção e composição do meio utilizado para elaborar o meio fermentativo se encontram apresentadas na Tabela 7, onde cada proporção foi representada pela letra H, de hidrolisado, e um número, representando sua respectiva proporção de hidrolisado. O inóculo, utilizado nesse processo, na proporção de 10%, foi realizado de acordo com o item 4.6.1, todavia, o pellet recuperado foi ressuspenso em meio fermentativo contendo o hidrolisado hemicelulósico nas diferentes concentrações, supracitadas. O processo de aclimatação, para fins comparativos, também foi realizado em meio fermentativo sintético (H0), ou seja, sem presença de hidrolisado hemicelulósico. Tabela 7. Composição dos meios fermentativos empregados na etapa de estudo da aclimatação das leveduras C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G em hidrolisado ácido de torta de girassol. Meio Fermentativo Composição H0 Meio sintético de composição 13,95 g L-1 de D-xilose, 4,71 g L-1, 5,0 g L-1 de extrato de levedura, 3,0 g L-1 de peptona e 3,0 g L-1 de malte. Sem adição de hidrolisado hemicelulósico. H25 Meio contendo 25% v/v de hidrolisado hemicelulósico proveniente de torta de girassol e 75% v/v de meio sintético, de composição descrita no item H0. H50 Meio contendo 50% v/v de hidrolisado hemicelulósico proveniente de torta de girassol e 50% v/v de meio sintético, de composição descrita no item H0. H75 Meio contendo 75% v/v de hidrolisado hemicelulósico proveniente de torta de girassol e 25% v/v de meio sintético, de composição descrita no item H0. H100 Meio contendo 100% de hidrolisado hemicelulósico proveniente de torta de girassol. - Meio Sintético; - Hidrolisado hemicelulósico. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. 60 O processo fermentativo para adaptação foi conduzido em batelada simples, em frascos Erlenmeyer de 50 mL contendo 30 mL de meio, referido em trecho anterior, sob agitação de 150 rpm em orbital-Shaker a 28°C. A partir desse processo, uma alíquota de 0,5 mL foi retirada de 4 h em 4 h para o monitoramento do crescimento microbiano, por contagem em câmara de Newbauer e densidade óptica (item 4.6.3.1), consumo de açúcares (glicose, xilose e arabinose) e produção de álcool, por HPLC. A partir dos resultados também foram calculados os seguintes parâmetros fermentativos: rendimento de etanol Yp/s (gproduto gsubstrato-1), produtividade volumétrica de etanol Qp (gproduto L-1 h-1), eficiência fermentativa Ef (%), taxa específica de crescimento microbiano µm (h-1) e tempo de geração (tg.). O processo fermentativo foi conduzido em três repetições. O processo teve início utilizando-se o meio sintético, H0, ou seja, sem adição de hidrolisado proveniente da torta de semente de girassol. Após a retirada de uma alíquota procedeu-se a centrifugação a 10000 rpm por 10 minutos e o pellet celular recuperado foi utilizado como inóculo no meio H25, contendo 25% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico e 75% (v/v) de meio sintético. Inóculos consecutivos foram realizados nos diferentes meios (H50, H75 e H100), cuja composição está descrita na Tabela 7, seguindo o procedimento apresentado anteriormente. A cada inóculo feito para um novo meio de fermentação com maior concentração de hidrolisado, as células aclimatadas provenientes do meio anterior foram, imediatamente, recuperadas por centrifugação e ressuspensas em água destilada estéril para posterior cultivo. A partir de uma alíquota de 10 µL, a linhagem aclimatada foi cultivada em meio YMPD sólido, contido em placas de Petri, por plaqueamento em superfície com auxílio de uma alça Drigalski. As culturas crescidas foram mantidas por repiques sucessivos e preparadas para conservação para disponibilização de posteriores estudos. O processo de aclimatação foi monitorado quanto ao crescimento por meio da densidade óptica, descrito no item 4.6.3.1, quanto a quantificação de açúcares redutores, descrito no item 4.6.3.4 e quanto a produção de etanol descrito no item 4.6.3.3. 4.7 Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de girassol com células aclimatadas As linhagens aclimatadas foram utilizadas como inóculo em um novo sistema de fermentação utilizando hidrolisado de torta de girassol “puro”, correspondente ao meio H100, para fins comparativos entre os parâmetros estudados com as células não aclimatadas. Na Figura 11 se encontra um fluxograma contendo as etapas desse estudo com células aclimatadas. 61 Legenda: A0 células não aclimatadas; A25 células aclimatadas em meio com 25% de hidrolisado de girassol; A50 células aclimatadas até o meio com 50% de hidrolisado de girassol; A75 células aclimatadas até o meio com 75% de hidrolisado de girassol; A100 células aclimatadas até o meio com 100% de hidrolisado de girassol. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 Figura 11. Fluxograma representativo das etapas de fermentação em hidrolisado hemicelulósico de girassol puro com as células das linhagens C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G aclimatadas. O bioprocesso também foi conduzido em batelada simples, em frascos Erlenmeyer de 50 mL, no entanto, contendo 30 mL de hidrolisado de torta de girassol (H100). O inóculo foi preparado de acordo com o item 4.6.1 e inoculado na mesma proporção utilizada nos demais processos fermentativos (10%), porém, com as leveduras C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G, aclimatadas. As condições de condução foram as mesmas descritas 62 nos processos anteriores, sob agitação de 150 rpm em orbital-Shaker a 28°C. O processo foi monitorado, seguindo os mesmos procedimentos do item 4.6.2., todavia, a cada 12 horas para determinação do crescimento e viabilidade celular por contagem em câmara de Neubauer e a cada 4 horas para as demais determinações: crescimento por densidade óptica (D.O) (item 4.6.3.1) e, consumo de açúcares (glicose, xilose e arabinose) e etanol, por HPLC. Os parâmetros fermentativos também foram calculados sendo estes: rendimento de etanol gproduto gsubstrato-1 (Yp/s), produtividade volumétrica de etanol (Qp gproduto L-1 h-1), eficiência fermentativa (Ef %), taxa específica de crescimento microbiano (µm) e Tempo de geração (tg.). O processo fermentativo, utilizando como agente do processo leveduras aclimatadas foi realizado em três repetições. Os processos fermentativos em hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol foram codificados de acordo com a concentração utilizada no processo de aclimatação das leveduras, onde os números (0, 25, 50, 75 e 100), representam a concentração de hidrolisado no meio de procedência da levedura (Tabela 8). Tabela 8. Siglas utilizadas para nomear células das leveduras Candida akabanensis UFVJM- R131 e Candida akabanensis UFVJM-R131 aclimatadas em diferentes condições Nomeação das leveduras aclimatadas em diferentes tempos A0 Células sem aclimatação A25 Células isoladas depois de 14h em meio H25 A50 Células isoladas depois de 14h em meio H50 A75 Células isoladas depois de 14h em meio H75 A100 Células isoladas depois de 14h em meio H100 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. 4.7.2 Monitoramento do Processo 4.7.1.1 Contagem de células e viabilidade celular A contagem de células e a determinação da viabilidade celular foram realizadas através de contagem em câmara de Neubauer (Figura 12) empregando azul de metileno como corante (ALVES, 1998). 63 Fonte: CAMPEBELL; CAMPEBELL (1986), modificado. Figura 12. Desenho esquemático da Câmara de Neubauer O azul de metileno é empregado como indicativo de viabilidade, ou seja, as células com alta atividade fisiológica (vivas) se apresentaram incolores e as células inativas, mortas, absorvem o corante se apresentando na cor azul. O resultado da contagem celular foi expresso em número de células mL-1 de acordo com a Equação 14. 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠𝑚𝐿 = 𝑛 × 𝑓𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜0,004 × 1000 Equação 14 Onde: 𝑛 = média de cinco contagens. 1000 = fator de conversão de mm3 para mL. 0,004 = volume do quadrado onde foi realizada a contagem. A porcentagem de viabilidade celular foi calculada de acordo com a Equação 15. 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (%) = 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠 + 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑜𝑟𝑡𝑎𝑠 × 100 Equação 15 4.7.2.2 Análises em cromatrografia líquida O sobrenadante obtido de cada ponto foi caracterizado quanto à concentração dos açúcares L-arabinose, D-xilose, D-glicose, bem como os teores de potenciais inibidores, ácido acético, furfural, 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) e ainda, do etanol e glicerol, por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com uso do sistema Shimadzu Prominence UPLC 20A, equipado com coluna Rezex ROA-Shodex ® (300 x 7.5 mm). Os padrões utilizados 64 para quantificação dos compostos e as condições operacionais empregadas para as análises se encontram na Tabela 2 e Tabela 3, citadas anteriormente. 4.7.2.3 Quantificação de açúcares redutores (AR) A quantificação de glicose e xilose foi realizada conforme descrito no item 4.6.3.3. 4.7.2.4 Parâmetros fermentativos a) Rendimento de etanol (Yp/s) O fator de conversão, que expressa a massa de etanol produzida por massa de açúcar consumida em gramas foi calculado pela Equação 16. 𝑌𝑃 𝑆⁄ = 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑧𝑖𝑑𝑜𝑎çú𝑐𝑎𝑟 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜 = 𝑃𝑆𝑖 − 𝑆𝑓 Equação 16 Onde: 𝑌𝑃 𝑆⁄ = rendimento em etanol (gp gs-1) 𝑃= concentração final de etanol (g L-1) 𝑆𝑖 = concentração inicial de açúcar presente no meio (g L-1) 𝑆𝑓 = concentração final de açúcar presente no meio (g L-1) b) Produtividade volumétrica de etanol (Qp g L-1 h-1) A produtividade volumétrica de etanol foi expressa com base na quantidade de etanol produzido (g L-1) por tempo de fermentação (h) e calculada de acordo com a Equação 17, a seguir: 𝑄𝑝 = 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑧𝑖𝑑𝑜𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜 = 𝑃𝑡 Equação 17 Onde: 𝑄𝑝= produtividade volumétrica (g L-1 h-1) 𝑃 = concentração final de etanol (g L-1) 𝑡 = tempo de fermentação (h) c) Eficiência Fermentativa - Ef (%) A eficiência fermentativa, expressa em %, representa a razão entre o fator de rendimento Yp/s (gp gs-1) obtido experimentalmente e o fator de rendimento teórico (Yt) de 0,511 65 g g-1 de glicose e/ou xilose consumida. Os valores serão obtidos por meio da Equação 18, a seguir: 𝐸𝑓 = 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑝𝑟á𝑡𝑖𝑐𝑜𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 = 𝑌𝑃 𝑆⁄0,511 𝑥100 Equação 18 Onde: 𝐸𝑓= eficiência fermentativa (%) 𝑌𝑃 𝑆⁄ = rendimento em etanol (g g-1) d) Consumo de substrato ΔS O consumo de substrato após o processo fermentativo foi calculado com o auxílio da Equação 19. ∆𝑆 = 𝑆𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑆𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 Equação 19 Onde: ∆𝑆= consumo de substrato durante o processo fermentativo (g L-1); 𝑆𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙= substrato (açúcar) restante ao final do processo fermentativo (g L-1); 𝑆𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙= substrato (açúcar) encontrado no início do processo fermentativo (g L-1); e) taxa específica de crescimento microbiano - µm Realizado de acordo com o descrito no item 4.6.3.4 f) Tempo de geração - tg. Realizado de acordo com o descrito no item 4.6.3.5 g) Produção de biomassa total - ΔX Realizado de acordo com o descrito no item 4.6.3.6 66 67 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Caracterização centesimal da biomassa Os resultados obtidos nos experimentos de caracterização físico-química do farelo de semente de girassol estão apresentados na Tabela 9. Tabela 9. Composição centesimal do farelo de semente de girassol (Helianthus annuus L.) Fração % Fração % Umidade 4,05±0,05 Lignina 3,40±0,19 Lipídios remanescentes 17,13±0,30 Celulose 14,44±0,51 Cinzas totais 3,56±0,13 Hemicelulose 15,32±2,18 FDN 40,80±0,93 Proteínas 26,50±1,17 FDA 25,48±1,29 Açúcares Solúveis Totais 1,33±0,05 Amido 13,94±1,05 FDN: Fibras em Detergente Neutro; FDA: Fibras em Detergente Ácido. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. O conteúdo celulósico encontrado da biomassa foi de 14,44±0,51% e o hemicelulósico foi de 15,32±2,18%. Essas frações, juntamente com as frações de açúcares solúveis totais (1,33±0,05%) e amido (13,94±1,05%), indicam que a biomassa é uma rica fonte de carboidratos, bem como potencial relevante para a produção de bioetanol 2G. A baixa porcentagem de lignina (3,40±0,19%) pode ser considerada uma característica vantajosa, visto que, devido à sua estrutura altamente complexa e a forte ligação com os conteúdos holocelulósicos (celulose e hemicelulose), sua despolimerização é uma tarefa laboriosa, mas necessária para garantir acesso aos polissacarídeos de parede. A presença da lignina ainda pode comprometer a etapa de fermentação O teor de lipídios remanescentes soma um total de 17,13±0,30% da biomassa. Quando comparado com os resultados obtidos por Matos (2017) que utiliza semente de girassol e metodologias semelhantes, o teor de lipídios encontrado foi de 44,41±0,03%, que representa um valor 27,28% maior que o encontrado no presente estudo. A procedência da biomassa utilizada por Matos (2017) foi obtida junto à empresa BIOSEP Complexo dos Lagos – Energia e Agronegócio Ltda, localizada no município de Três Pontas, MG, onde havia sido submetida à extração de óleo através de prensagem. Enquanto que a biomassa obtida no presente estudo foi adquirida no mercado local, como descrito no item 4.1, e ainda submetida a uma extração química, utilizando éter etílico, para retirada do óleo contido em suas sementes. Tais resultados 68 indicam que a extração química com éter etílico foi mais eficiente quando comparada com a extração feita por prensagem. 5.2 Caracterização do hidrolisado ácido de torta de girassol Os resultados referentes à composição química do hidrolisado hemicelulósico encontram-se na Tabela 10. As concentrações de açúcares obtidas foram de 4,94±0,31 g L-1 de glicose, 14,91±0,86 g L-1 de xilose e 8,99±0,55 g L-1 de arabinose. A concentração de açúcares de 5 carbonos foi maior que os açúcares de 6 carbonos, fato já esperado uma vez que o pré- tratamento com ácido é geralmente eficaz na desconstrução da hemicelulose, disponibilizando monossacarídeos (MANZANARES et al., 2020; SUHARTINI et al., 2022). Os teores de inibidores observados foram de 0,01±0,01 g L-1 de furfural, 0,30±0,02 g L-1 de 5- hidroximetilfurfural, 3,81±0,21 g L-1 de ácido acético e 0,71±0,01 g L-1 de glicerol. Tabela 10. Composição química do hidrolisado ácido hemicelulósico do farelo de girassol Frações Hidrolisado de torta de Girassol (g L-1) Furfural 0,01±0,01 5-Hidroximetilfurfural 0,30±0,02 Ácido acético 3,81±0,21 Glicerol 0,71±0,01 D-Glicose 4,94±0,31 D-xilose 14,91±0,86 L-arabinose 8,99±0,55 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. 5.3 Reativação e autenticação dos micro-organismos No processo de reativação foi observado que as culturas estudadas, mesmo com um período longo de conservação, apresentaram rápido crescimento e aspecto morfológico característico das colônias. As características morfológicas macroscópicas e microscópicas observadas indicavam se tratar de culturas puras sem contaminação por outros micro- organismos. 69 5.4.1 Caracterização e identificação morfológica das leveduras a) Ensaios morfológicos macroscópicos A levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 crescidos em Meio YMPDX, YMPD, YPX e ágar-ágar (AA) a 28°C por 48 horas, pode ser observada na Figura 13. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 13. Aspecto morfológico macroscópico da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 em meio YMPDX (A), YMPD (B), YPX (C) e ágar-ágar AA (D) após 96 horas de crescimento. O morfotipo observado da linhagem C. akabanensis UFVJM-R131 apresentava aspecto cremoso, forma circular, com bordas lisas e perfil achatado. O crescimento foi radial e concêntrico e a linhagem não apresentou pigmentação. Valinhas et al. (2018) também 70 identificaram que a linhagem, quando cultivada em meio YMPD, apresentou aspecto cremoso, bordas lisas, e perfil achatado. O morfotipo da linhagem Candida orthopsilosis UFVJM-4G, crescidos em Meio YMPDX, YPMD, YMPX e ágar-ágar (AA) a 28°C por 48 horas, pode ser observado na Figura 14. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 14. Aspecto morfológico macroscópico da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G em meio YMPDX (A), YMPD (B), YMPX (C) e ágar-ágar AA (D) após 96 horas de crescimento. A linhagem Candida orthopsilosis UFVJM-4G apresentou coloração branco- amarelada, forma circular, aspecto cremoso, com superfície lisa e crescimento radial. Bordas rugosas com aspecto filamentoso e perfil achatado também foi observado. De acordo com Barbosa (2017) a linhagem apresentou aspecto cremoso, coloração creme, superfície e bordas lisas e perfil achatado, quando cultivada em meio YMPD, características que corroboram com as observadas neste trabalho. 71 b) Velocidade de crescimento microbiano Na Tabela 11 encontra-se descrito os tamanhos das colônias em função do tempo de crescimento das linhagens cultivadas em cada um dos meios à 28ºC por 96 horas. Tabela 11. Tamanho das colônias da linhagem Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G em função do tempo em diferentes meios de cultivo Tempo (h) Tamanho da colônia em meio YMPDX (mm) Tamanho da colônia em meio YMPD (mm) Tamanho da colônia em meio YPX (mm) Candida akabanensis UFVJM-R131 24 8 7 9 48 10 8 9 72 12 10 11 96 12 11 12 Candida orthopsilosis UFVJM-4G 24 8 7 8 48 9 8 8 72 13 13 14 96 15 15 17 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Todas as colônias podem ser consideradas de tamanho grande, visto que em 24h, obtiveram diâmetro de colônia maior que 5 mm (DIAS; SCHWAN, 2010). Os micro-organismos, quando cultivados em meio ágar-ágar, à 28°C, obtiveram um crescimento pouco expressivo. Nenhuma linhagem estudada apresentou crescimento após 24h de cultivo. A linhagem UFVJM-R131 apresentou diâmetro de 6 mm e a linhagem UFVJM-4G apresentou diâmetro de 5 mm em um período de 96 h quando cultivadas neste meio. Vale ressaltar que o meio ágar-ágar (AA), constituído apenas de ágar, não possui substratos e nutrientes para as leveduras se desenvolverem. Este meio tem como finalidade principal estressar o micro-organismo, para que seja possível observar estruturas como ascos e ascósporos. As descrições macroscópicas, microscópicas e crescimento da colônia das linhagens C. akabanensis UFVJM-R131 e C. orthopsilosis UFVJM-4G obtidas no presente estudo corroboram com as características descritas por Valinhas et al. (2018), Barbosa et al. (2017) e por KURTZMAN et al. (2011). c) Ensaios morfológicos microscópicos A linhagem UFVJM-R131, em relação ao aspecto microscópico (Figura 15), apresentou células globosas e elipsoides (Figura Erro! Fonte de referência não e ncontrada.15 C), presença de blastoconídios, brotamento unilateral (ver destaque da Figura 15 72 A), bem como a formação de pseudo-hifas (ver destaque da Figura 15 B). A observação microscópica revelou a presença de ascos com ascósporo (ver destaques 1 e 2 da Figura 15 D) e uma célula com vacúolo e em brotamento (ver destaque 3 da Figura 15 D). Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 15. Aspecto morfológico microscópico da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 em meios A) e B) YMPX, em lente de aumento de 40x, C) YPX, em lente de aumento de 40x e D) ágar-ágar AA em lente de aumento de 100x. Valinhas et al. (2018) identificou que a linhagem C. akabanensis UFVJM-R131 também apresentou células globosas, formação de pseudo-hifa e presença de ascósporo e blastoconídios quando cultivada em meio YMPD. A análise microscópica da linhagem Candida orthopsilosis UFVJM-4G apontou células globosas e oblongas, com brotamento unipolar (ver destaque 2, Figura 16 A), bipolar (ver destaque 1 da Figura 16 A) e multipolar (ver destaque 3 da Figura 16 A). Na Figura 16 A pode ser observado várias fases de crescimento da levedura. A presença de ascósporos (ver destaque da Figura 16 B), blastoconídios (ver destaque 4 da Figura 16 A), tubos germinativos com constrição (ver destaque da Figura 16 E) e pseudo-hifas (ver destaques das Figura 16 C e Figura 16 D) também são observadas. Barbosa (2017) também observou a presença de 73 ascósporo, blastoconidios, e reprodução por brotamento multipolar ao analisar a linhagem C. orthopsilosis UFVJM-4G em meio YMPD. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 16. Aspecto morfológico microscópico da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G em meios A) e B) YMPD, em lente de aumento de 100x, C) YPX, em lente de aumento de 40x, D) Ágar-acetato AC em lente de aumento de 40x, E) ágar-ágar AA em lente de aumento de 40x. 5.5 Curva de crescimento microbiano Uma curva de crescimento microbiano padrão é composta por quatro fases de distintas, tais como, fase de latência, fase exponencial, fase estacionária e fase de declínio. A fase de latência, também denominada de fase lag, é um intervalo inicial no qual não há reprodução celular. Apesar de não haver reprodução, há uma intensa atividade metabólica preparatória, que envolve a síntese de enzimas e moléculas necessárias para que a célula 74 sobreviva no meio de cultivo (TORTORA et al., 2017). A fase exponencial, também conhecida como fase log, compreende o momento em que os micro-organismos se multiplicam em uma velocidade máxima (taxa de crescimento máxima µm) e com constância tempo de geração (tg), intervalo no qual a quantidade de células da população microbiana dobra (NICOLAU, 2014). As células, durante a fase exponencial, estão saudáveis e com maior atividade metabólica. Posteriormente, o crescimento torna-se limitado devido à escassez de nutrientes e, portanto, instaura-se a fase estacionária. Nessa fase, há um momento de equilíbrio, pois a quantidade de células que nascem é a mesma quantidade de células que morrem (MADIGAN et al., 2016). Os procedimentos biossintéticos e a produção de metabólitos podem continuar durante a fase estacionária, todavia em uma velocidade reduzida. Como resultado do esgotamento de nutrientes, a população microbiana entra em fase de declínio ou morte, no qual o número de células mortas excede o número de células vivas (TORTORA et al., 2017). O perfil de crescimento e o perfil de consumo de açúcares da linhagem Candida akabanensis UFVJM-R131 podem ser observados na Figura 17. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 17. Perfil de crescimento e de consumo de açúcar da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM- R131 quando cultivada em meio YPMX A observação do gráfico permite averiguar que, quando cultivada em meio sintético, o crescimento da levedura não apresenta fase de latência (fase lag), visto que o inóculo 0,1 1 10 0 10 20 30 40 50 60 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 D en si da de ó pt ic a (6 10 nm ) C on ce nt ra çã o (g /L ) Tempo (h) Xilose Crescimento 75 é proveniente de uma cultura em crescimento exponencial. A taxa específica de crescimento µm é a velocidade máxima e constante de reprodução celular presente na fase denominada logarítmica ou exponencial da curva de crescimento (SCHMIDELL et al., 2001). Essa velocidade de crescimento celular máxima (µm) em meio YPMX, utilizando a Candida akabanensis UFVJM-R131 foi de 0,23±0,00 h-1. O tempo de geração de um micro-organismo é definido como o tempo necessário para que ocorra formação de duas novas células a partir da célula existente e esse parâmetro pode variar entre os micro-organismos e depende da composição do meio de crescimento e das condições ambientais (SCHMIDELL et al., 2001). O tempo mínimo de geração para as leveduras está compreendido entre 1,5 e 2 horas (SCHMIDELL et al., 2001) e o tempo de geração calculado no meio sintético YPMX utilizando a levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 foi de 3,03±0,07 h. A Figura 18 apresenta um gráfico que relaciona a densidade óptica medida e a concentração de células em peso seco (g L-1) referente. A equação obtida com a construção do gráfico relaciona concentração e densidade óptica e, dessa maneira foi possível calcular a concentração de biomassa celular (g L-1) da levedura C. akabanensis UFVJM-R131 ao final das fermentações. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 18. Relação entre densidade óptica e peso seco de um cultivo de Candida akabanensis UFVJM-R131 em meio sintético YPMX. y = 1,7269x R² = 0,9871 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 - 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 D O Concentração (g/L) 76 O perfil de crescimento e o perfil de consumo de açúcares da linhagem Candida orthopsilosis UFVJM-4G podem ser observados na Figura 19. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 19. Perfil de crescimento e de consumo de açúcar da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM- 4G quando cultivada em meio YPMX A observação do gráfico permite averiguar que, quando cultivada em meio sintético, a levedura C. orthopsilosis não apresentou fase de latência. A taxa de crescimento celular (µmáx) da levedura foi de 0,21±0,01 h-1 e o tempo de geração foi de 3,33±0,18 h. A partir dos dados do gráfico acima, foi decidido que, no processo de aclimatação, o repique utilizado para o meio sucessivo seria realizado no momento em que a linhagem atingir 3,0 DO, visto que essa estaria em crescimento exponencial, onde as células se encontram saudáveis e intensa reprodução. A Figura 20 apresenta um gráfico que relaciona a densidade óptica medida e a concentração de células (g L-1) referente. Dessa maneira, com a equação obtida pelo gráfico, que relaciona concentração com densidade óptica, foi possível calcular a concentração de biomassa celular (g L-1) da C. orthopsilosis UFVJM-4G ao final das fermentações. 0,1 1 10 9 14 19 24 29 34 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 D en si da de ó pt ic a (6 10 n m ) C on ce nt ra çã o (g /L ) Tempo (h) Xilose Crescimento 4G 77 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 20. Relação entre densidade óptica e peso seco de um cultivo de Candida orthopsilosis UFVJM-4G em meio sintético YPMX. 5.6 Adaptação Celular As leveduras foram submetidas ao processo de transferências sucessivas a partir do meio H0 até o meio H100, conforme descrito no item 4.6. As Figuras 21 e 22 apresentam o perfil de crescimento microbiano, durante a adaptação seletiva, das leveduras Candida akabanensis UFVJM-R131 e Candida orthopsilosis UFVJM-4G por 36h. Os gráficos apresentados demonstram que as duas linhagens de leveduras conseguiram crescer em todos os meios no qual foram inoculadas. Constata-se uma fase de latência, ou fase lag, nas primeiras 4h de fermentação no meio contendo 100% de hidrolisado. A duração da fase de latência depende da natureza do meio de cultivo e das condições do micro-organismo. Quando a condição do meio fermentativo for estressante para a levedura, a fase de latência tende a se estender por um período maior. Se o inóculo for proveniente de uma cultura antiga ou com baixa viabilidade celular, ou consiste em células que sofreram algum tipo de dano decorrente de agentes estressantes, em geral, a fase lag se estenderá (MADIGAN et al., 2016). A adaptação celular é uma alternativa que pode ser utilizada para diminuir a duração dessa fase ao criar células mais resistentes à ambientes estressantes (STRATFORD et al., 2014). y = 2,2725x R² = 0,9601 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 - 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 D O Concentração (g/L) 78 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 21. Curva de crescimento microbiano da levedura Candida akabanensis em meio sintético (H0), meio contendo 25% de hidrolisado (H25), 50% de hidrolisado (H50), 75% de hidrolisado (H75) e meio contendo apenas hidrolisado (H100). Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 22. Curva de crescimento microbiano da levedura Candida orthopsilosis em meio sintético (H0), contendo 25% de hidrolisado (H25), 50% de hidrolisado (H50), 75% de hidrolisado (H75) e meio contendo apenas hidrolisado (H100). 0,1 1,0 10,0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 C re sc im en to - D O 6 10 nm Tempo (horas) H0 H25 H50 H75 H100 0,1 1,0 10,0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 C re sc im en to - D O 6 10 n m Tempo (horas) H0 H25 H50 H75 H100 79 O processo de adaptação das células foi acompanhado através de micrografias. A Figura 23 contém imagens das células utilizadas como inóculo para o início do processo de aclimatação, demonstrando células saudáveis, puras e sem contaminação. As células da levedura C. akabanensis UFVJM-R131 são perceptivelmente menores que as células da levedura C. orthopsilosis UFVJM-4G. Células menores podem apresentar maior capacidade de permuta de nutrientes e produtos de excreção, quando comparadas às células maiores, e essa vantagem metabólica pode afetar o crescimento e outras propriedades (MADIGAN et al., 2016). Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 23. Aspecto morfológico microscópico, em lente de aumento de 40x, das leveduras A) Candida akabanensis UFVJM-R131 e B) Candida orthopsilosis UFVJM-4G utilizadas como inóculo para iniciar o processo de aclimatação. O processo de adaptação das células foi acompanhado através de micrografias. A Figura 24 contém um agregado de fotos que demonstram a evolução das células da C. akabanensis durante o processo de adaptação. As micrografias apresentadas abaixo, realizadas depois de 14h de fermentação, não nos permitem identificar outras estruturas celulares, além da vultosa presença de blastoconídios. Essa numerosa presença de brotamentos se deve ao fato de que a levedura se encontrava em sua fase exponencial de crescimento. 80 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 24. Aspecto morfológico microscópico da levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 após crescimento em meio A) H25, B) H50, C) H75, D) H100, observadas em lente de aumento de 100x. A Figura 25 evidencia a evolução das células da C. orthopsilosis durante o processo de adaptação evolutiva. A microscopia permite observar que a linhagem criou agregados de células a partir do meio contendo 50% de hidrolisado. Os agregados, ou flocos, são aglomerados de células de levedura que permitem que essas protejam suas células de ambientes hostis, suportando o estresse (RAJASEKHARAN; LEE; LEE, 2019). A utilização de um agente fermentativo floculante pode facilitar o processo de fermentação industrial (FRAGA PACHECO, 2010). Em uma produção industrial em batelada de bioetanol, as células do agente fermentativo precisam ser recuperadas após a etapa de fermentação (WATANABE; NAKAMURA; SHIMA, 2009). A principal vantagem de células floculantes é a capacidade de serem recuperadas por meio da sedimentação, pois condiz com um processo fermentativo menos oneroso, devido à diminuição de custos com filtração ou centrifugação para retirada da biomassa celular (SANTOS, 2014). 81 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 25. Aspecto morfológico microscópico da levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G após crescimento em meio A) H25, B) H50, C) H75, D) H100, observadas em lente de aumento de 40x. 5.7 Fermentação em hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol 5.7.1 Candida akabanensis UFVJM-R131 A Figura 26 apresenta o perfil de consumo de açúcares redutores da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131. Ao observar as curvas das linhagens R131-A0 e R131-A25, constata-se que o consumo dos açúcares se iniciou após 4 horas de fermentação, enquanto as linhagens R131-A50, R131-A75 e R131-A100 consumiram os substratos desde o início do processo fermentativo. 82 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 Figura 26. Perfil de consumo de açúcares redutores das linhagens de leveduras Candida akabanensis UFVJM-R131 não aclimatada (A0) e aclimatadas (A25, A50, A75 e A100). O consumo de xilose, glicose e arabinose, a produção de etanol e o crescimento celular da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 aclimatada (R131-A25, R131-A50, R131-A75 e R131-A100) e não aclimatada (R131-A0), mensurados por meio de cromatografia líquida de alta eficiência, estão indicados na Figura 27. O açúcar arabinose presente no hidrolisado não foi assimilado pela levedura. Contudo, o micro-organismo consumiu glicose e xilose, produzindo etanol. 5 10 15 20 25 30 0 4 8 12 16 20 A çú ca re s re d u to re s (g L -1 ) Tempo (horas) A0 A25 A50 A75 A100 83 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 27. Perfil de consumo de açúcares (glicose, xilose e arabinose), produção de etanol e crescimento celular durante fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol pela linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 não aclimatada (R131-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (R131-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (R131-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (R131-A75) e aclimatada em hidrolisado (R131-A100). 84 As curvas contendo o consumo de xilose e de glicose a partir das linhagens aclimatadas e não aclimatada foram reunidos na Figura 28, para fins comparativos. A glicose foi totalmente consumida em 8 horas de fermentação, enquanto a xilose não foi totalmente consumida mesmo após 28 horas de fermentação. As curvas de consumo de xilose e glicose pela levedura C. akabanensis UFVJM-R131 aclimatada e não aclimatada tiveram perfis semelhantes, resultado que será confirmado com as análises estatísticas posteriormente. Contudo, ao comparar essas curvas com as curvas da Figura 26 de consumo de açúcares redutores totais, há uma contraposição de resultados, visto que houve diferenciação entre as curvas da R131-A0 e R131-A25 em relação as outras R131-A50, R131-A75 e R131-A100. Pode-se levantar a hipótese da presença de um quarto açúcar no hidrolisado ácido de farelo de girassol, além da glicose, xilose e arabinose, bem como a suposição de que a velocidade de consumo desse açúcar desconhecido foi maior com a aclimatação da levedura. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 28. Consumo de glicose (A) e xilose (B) pela levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 em fermentação com hidrolisado ácido de farelo de girassol. O perfil de crescimento das células aclimatadas e não aclimatada foi agrupado em um gráfico (Figura 29) para fins comparativos, de forma que foi possível perceber que as células aclimatadas (R131-A25 a R131-A100) da C. akabanensis UFVJM-R131 obtiveram perfis de crescimento semelhantes à linhagem não aclimatada (R131-A0). A fase lag, ou de latência, praticamente não existe nas curvas analisadas da C. akabanensis. 0 1 2 3 4 5 0 4 8 12 16 20 24 28 C on ce nt ra çã o (g /L ) Tempo (h) Consumo de glicose por C. akabanensis UFVJM-R131 R131 A0 R131 A25 R131 A50 R131 A75 R131 A100 0 2 4 6 8 10 12 14 0 4 8 12 16 20 24 28 C on ce nt ra çã o (g /L ) Tempo (h) Consumo de xilose por C. akabanensis UFVJM-R131 R131 A0 R131 A25 R131 A50 R131 A75 R131 A100 A B 85 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 29. Perfil de crescimento das células da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 não aclimatada (A0) e aclimatadas (R131-A25 e R131-A100) em hidrolisado hemicelulósico de farelo de girassol. A Tabela 12 apresenta os resultados da viabilidade celular das células aclimatadas e não aclimatada durante a fermentação em hidrolisado hemicelulósico de girassol. A Figura 30 mostra os gráficos construídos com a quantidade de células vivas, mortas, totais, bem como a viabilidade celular. A viabilidade celular manteve-se alta, entre 82-91%, mesmo após 36 horas de fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol. Tabela 12. Viabilidade celular das células das leveduras Candida akabanensis UFVJM-R131 aclimatadas e não aclimatada durante o processo de fermentação em hidrolisado hemicelulósico de girassol 0 h 12 h 24 h 36 h Candida akabanensis UFVJM- R131 A0 73,88% 96,90% 90,46% 86,13% A25 69,37% 96,70% 96,28% 88,10% A50 88,71% 94,17% 96,52% 86,13% A75 87,36% 95,30% 92,91% 90,50% A100 84,85% 92,84% 92,81% 82,50% Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 0 1 10 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 D en si da de ó pt ic a (6 10 n m ) Tempo (horas) R131-A0 R131-A25 R131-A50 R131-A75 R131-A100 86 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 30. Quantidade de células vivas e mortas e viabilidade celular da linhagem de levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 não aclimatada (R131-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (R131-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (R131-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (R131- A 75) e aclimatada em hidrolisado (R131-A100). 0% 20% 40% 60% 80% 100% 0 200 400 600 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 V ia bi li da de c el ul ar M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. akabanensis UFVJM-R131 A0 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 0% 20% 40% 60% 80% 100% 0 100 200 300 400 500 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 V ia bi li da de c el ul ar M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. akabanensis UFVJM-R131 A25 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 0% 20% 40% 60% 80% 100% 0 100 200 300 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 V ia bi li da de c el ul ar M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. akabanensis UFVJM-R131 A50 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 0% 50% 100% 0 100 200 300 400 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 V ia bi li da de c el ul ar M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. akabanensis UFVJM-R131 A75 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 0% 20% 40% 60% 80% 100% -50 50 150 250 350 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 V ia bi li da de c el ul ar M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. akabanensis UFVJM-R131 A100 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 87 Os parâmetros de crescimento celular (taxa específica máxima de crescimento, tempo de geração) foram calculados durante as 8 primeiras horas de fermentação, enquanto a produção de biomassa total foi calculada após 36 h de fermentação. Os resultados se encontram na Tabela 13. Tabela 13. Parâmetros de crescimento da fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol com a levedura Candida akabensis UFVJM-R131 não aclimatada (R131-A0) e aclimatada (R131-A25, R131-A50, R131-A75, R131-A100) Candida akabanensis UFVJM-R131 Parâmetros R131-A0 R131-A25 R131-A50 R131-A75 R131-A100 µmáx (h-1) 0,22±0,08a 0,17±0,04a 0,23±0,04a 0,31±0,02a 0,21±0,03a tg (h) 3,62±1,31a 4,21±0,86a 3,13±0,49a 2,24±0,11a 3,31±0,46a Produção de biomassa (g/L) 1,88±0,37a 2,13±0,18a 2,12±0,26a 2,12±0,16a 2,05±0,29a Letras iguais na linha correspondente indicam que não há diferença estatística ao nível de 95% de significância. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. A taxa específica de crescimento máxima (µmáx) e o tempo de geração (tg) da levedura C. akabanensis em hidrolisado ácido foi similar à fermentação em meio sintético YPMX (µmáx 0,23±0,00 h-1 e tg 3,03±0,07 h). Através dos resultados obtidos, infere-se que o crescimento das células aclimatadas não foi afetado após a adaptação. A Figura 31 mostra as concentrações de compostos inibidores como 5- hidroximetilfurfural (5-HMF), furfural, ácido acético e glicerol durante a fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol com as leveduras C. akabanensis UFVJM-R131. As células da linhagem aclimatadas e não aclimatada foram capazes de assimilar compostos tóxicos como furfural e 5-hidroximetilfurfural (5-HMF). De acordo com Gencturk e Ulgen (2022), as leveduras são capazes de eliminar o 5-HMF por redução, gerando compostos de menor toxicidade, o que foi observado pela diminuição na concentração desse composto. Essa conversão pode ocasionar uma fase de latência maior, todavia, esse fato não foi observado no perfil de crescimento das células. O glicerol foi produzido durante o processo de fermentação, todavia em concentrações baixas. Este co-produto pode estar relacionado ao estresse osmótico causado pelo hidrolisado ácido, uma vez que o glicerol atua como osmorregulador, que mantém o equilíbrio da quantidade de água e sais minerais no meio intracelular (CAMPOS, 2015). 88 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 31. Quantidade de células vivas e mortas e viabilidade celular da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G não aclimatada (4G-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (4G-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (4G-AA50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (4G-A 75) e aclimatada em hidrolisado (4G-A100). 89 Os resultados referentes à produção de etanol e parâmetros fermentativos estão apresentados na Tabela 14. O rendimento de etanol (YP/S). eficiência fermentativa (Ef), produtividade volumétrica (Qp) e taxa de consumo de xilose (-rxilose) foram calculados após 12 h de fermentação. A taxa de consumo de glicose (-rglicose) foi calculada com 4 h de fermentação, visto que com 8 h, o substrato já havia sido totalmente consumido. A produção total de etanol (ΔP) e o consumo total de substrato (ΔS) foram calculados com 28 h de fermentação. Tabela 14. Parâmetros do processo fermentativo conduzido com as linhagens aclimatadas e não aclimatadas da levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 em hidrolisado hemicelulósico de semente de girassol Candida akabanensis UFVJM-R131 Linhagens R131-A0 R131-A25 R131-A50 R131-A75 R131-A100 YP/S (gp gs-1) 0,34±0,02a 0,42±0,03a 0,43±0,01a 0,43±0,02a 0,43±0,10a Ef (%) 66,11±0,03a 81,45±0,06a 84,28±0,03a 84,80±0,04a 86,42±0,19a QP (g L-1 h-1) 0,31±0,04a 0,35±0,02a 0,34±0,02a 0,34±0,02a 0,35±0,01a ΔS (gaçúcar L-1) 16,90±1,96a 15,70±0,40a 15,03±0,14a 14,84±0,58a 15,06±1,74a ΔP (getanol L-1) 5,05±0,32a 4,91±0,72a 5,47±0,08a 5,38±0,04a 5,28±0,07a -rglicose (h-1) 0,62±0,04a 0,61±0,02a 0,58±0,01a 0,58±0,01a 0,58±0,04a -rxilose (h-1) 0,47±0,06a 0,44±0,05a 0,42±0,02a 0,41±0,01a 0,41±0,08a Letras iguais na linha correspondente indicam que não há diferença estatística ao nível de 95% de significância. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 Entre os valores encontrados dos parâmetros fermentativos das linhagens R131-A0 a R131-A100, pode-se observar que, para o tempo de fermentação considerado (28 h), não houve diferença estatística entre os tratamentos. Os consumos de glicose e xilose entre as células aclimatadas e não aclimatada foram estatisticamente iguais. A produção de etanol foi de aproximadamente 5,0 g L-1 para todas as linhagens e a produtividade volumétrica, concentração de etanol produzida por hora de fermentação, também não obteve diferenciações entre as aclimatações. O rendimento de etanol também foi o mesmo entre as células aclimatadas e não aclimatada. 5.7.2 Candida orthopsilosis UFVJM-4G A Figura 32 apresenta, no primeiro gráfico, o perfil de consumo de açúcares redutores da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G. As curvas de consumo de açúcares redutores demonstram que a assimilação do substrato foi baixa durante as primeiras 90 4 horas de fermentação, com exceção da 4G-A50. A linhagem 4G-A0, somente iniciou o processo de assimilação dos açúcares após 8 horas de processo fermentativo. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 Figura 32. Perfil de consumo de açúcares redutores da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G, não aclimatada (4G-A0) e aclimatadas (4G-A25 a 4G-A100) A Figura 33 exibe os gráficos de consumo de açúcares, a produção de etanol e o crescimento celular da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G cuja células foram aclimatadas (4G-A25, 4G-A50, 4G-A75 e 4G-A100) em comparação com a linhagem não aclimatada (4G-A0). Evidentemente observa-se a produção de etanol por todas as células. A partir da análise do consumo de açúcares, glicose e xilose, é possível observar que as células 4G-A0 e 4G-a25 iniciaram a assimilação desses substratos mais tardiamente, em comparação como 4G-A50, 4G-A75 e 4G-A100. A arabinose, contudo, manteve sua concentração constante, indicando que a levedura não foi capaz de assimilar esse açúcar. As curvas de consumo de glicose e xilose foram agrupadas na Figura 34, para melhor percepção comparativa. 0 5 10 15 20 25 0 4 8 12 16 20 A çú ca re s re d u to re s (g L -1 ) Tempo (horas) A0 A25 A50 A75 A100 91 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 33. Perfil de consumo de açúcares (glicose, xilose e arabinose), produção de etanol e crescimento celular durante fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol pela linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G não aclimatada (4G-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (4G-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (4G-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (4G-A75) e aclimatada em hidrolisado (4G-A100). 92 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 Figura 34. Consumo de glicose (A) e xilose (B) pela levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G em fermentação com hidrolisado ácido de farelo de girassol. O consumo de glicose foi evidentemente mais rápido quando assimilado pelas leveduras 4G-A50, 4G-A75 e 4G-A100, sendo que essa última consumiu completamente o substrato em 8 horas de fermentação. O consumo de xilose pelas leveduras 4G-A0 e 4G-A25 foi pequeno entre 0 e 8 horas, havendo um atraso em relação às outras células aclimatadas. Esses resultados serão confirmados, de modo estatístico, posteriormente. A Figura 35 reúne as curvas de crescimento da linhagem de levedura Candia orthopsilosis UFVJM-4G não aclimatada e aclimatadas. A levedura não aclimatada 4G-A0 e aclimatada em 25% de hidrolisado 4G-A25 demonstraram curvas de crescimento visivelmente diferentes das curvas de 4G-A50, 4G-A75 e 4G-A100, no qual se observa menor crescimento celular e uma fase de latência entre 0 e 4 horas. Esses são os primeiros indícios de um possível sucesso de aclimatação para a Candida orthopsilosis UFVJM-4G, que poderão ser confirmados estatisticamente. 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 0 4 8 12 16 20 24 28 C on ce nt ra çã o (g /L ) Tempo (h) Consumo de glicose por C. orthopsilosis UFVJM-4G 4G A0 4G A25 4G A50 4G A75 4G A100 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 0 4 8 12 16 20 24 28 C on ce nt ra çã o (g /L ) Tempo (h) Consumo de xilose por C. orthopsilosis UFVJM-4G 4G A0 4G A25 4G A50 4G A75 4G A100 A B 93 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 35. Perfil de crescimento das células da linhagem de levedura e Candida orthopsilosis UFVJM-4G em hidrolisado hemicelulósico de torta de girassol. Os parâmetros de crescimento celular (taxa específica máxima de crescimento, tempo de geração) foram calculados durante as 4 primeiras horas de fermentação, enquanto a produção de biomassa total foi calculada após 36 h de fermentação. Os resultados se encontram na Tabela 15. Tabela 15. Parâmetros de crescimento da levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 Candida orthopsilosis UFVJM-4G Parâmetros A0 A25 A50 A75 A100 µmáx (h-1) 0,07±0,02b 0,21±0,00ab 0,28±0,03ab 0,42±0,11a 0,27±0,01ab tg (h) 11,55±3,75a 3,34±0,08b 2,52±0,25b 1,73±0,40b 2,60±0,11b Produção de biomassa (g L-1) 1,20±0,2ab 1,00±0,01b 1,62±0,72ab 1,99±0,04a 2,06±0,16a Letras iguais na linha correspondente indicam que não há diferença estatística ao nível de 95% de significância. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Os parâmetros de taxa específica máxima de crescimento (µmáx) das células 4G- A75 foi maior que das outras células e, consequentemente, o tempo de geração foi menor. O aumento da velocidade de crescimento e a diminuição do tempo de geração são fatores 0 1 10 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 D en si da de ó pt ic a (6 10 n m ) Tempo (horas) 4G-A0 4G-A25 4G-A50 4G-A75 4G-A100 94 significativos para um processo industrial. A quantidade de biomassa celular total foi maior nas células 4G-A75 e 4G-A100, indicando que o processo de adaptação celular foi eficiente para o aumento do crescimento microbiano. A taxa específica de crescimento máxima (µmáx) para as células não adaptadas foi menor em hidrolisado ácido (0,07±0,02), quando comparada com a taxa de crescimento da mesma levedura em meio sintético YPMX (0,21±0,01 h-1). O tempo de geração da levedura em hidrolisado (11,55±3,75) foi, consequentemente, maior quando comparado ao meio sintético (3,33±0,18 h). A resposta aos valores encontrados desses parâmetros deve-se ao desafio da utilização de hidrolisados ácidos em bioprocessos, devido à presença dos compostos que atuam como inibidores para a maioria dos micro-organismos, sejam esses modificados ou não (YAMAKAWA et al., 2022). Infere-se que o meio hidrolisado, por possuir presença de compostos inibidores, prejudicou o crescimento da Candida orthopsilosis. Contudo, esse mesmo resultado não foi percebido para as outras células adaptadas, indicando que o processo de adaptação auxiliou as células a tolerar o ambiente inóspito. A Tabela 16 apresenta os resultados da viabilidade celular das células aclimatadas e não aclimatada durante a fermentação em hidrolisado ácido de semente de girassol. A Figura 36 mostra os gráficos construídos com a quantidade de células vivas, mortas, totais, bem como a viabilidade celular. Sabendo que quanto maior o número de leveduras viáveis, melhor será o desempenho do processo, é possível afirmar que as células ainda estavam viáveis ao final da fermentação de 36 h, visto que a porcentagem de viabilidade celular se encontrava alta, entre 85 e 91%. A contagem de células da linhagem C. orthopsilosis pode ter sido prejudicada pelos agregados de células formados, pois impossibilitava a contagem de células. Tabela 16. Viabilidade celular das células da levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G aclimatadas durante o processo de fermentação em hidrolisado hemicelulósico de girassol 0 h 12 h 24 h 36 h Candida orthopsilosis UFVJM-4G 4G-A0 85,29% 95,31% 92,64% 86,96% 4G-A25 67,74% 96,55% 97,27% 89,74% 4G-A50 92,00% 95,28% 95,71% 90,86% 4G-A75 93,52% 95,54% 95,71% 89,10% 4G-A100 94,51% 94,38% 95,12% 85,49% Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. 95 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 36. Quantidade de células vivas e mortas e viabilidade celular da linhagem de levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G não aclimatada (4G-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (4G-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (4G-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (4G-A 75) e aclimatada em hidrolisado (4G-A100).Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. 0% 50% 100% 0 50 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. orthopsilosis UFVJM-4G A0 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 0% 50% 100% 0 50 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. orthopsilosis UFVJM-4G A25 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 0% 50% 100% 0 50 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. orthopsilosis UFVJM-4G A50 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 0% 50% 100% 0 50 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. orthopsilosis UFVJM-4G A75 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 0% 50% 100% 0 50 100 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 M il hõ es d e C él ul as p o m L Tempo (h) C. orthopsilosis UFVJM-4G A100 Total de células Células vivas Células mortas Viabilidade Celular 96 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022. Figura 37. Concentração dos compostos glicerol, ácido acético, 5-hidroximetilfurfural e furfural durante fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol a partir da levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G não aclimatada (4G-A0) , aclimatada em meio contendo 25% de hidrolisado (4G-A25), aclimatada em meio contendo 50% de hidrolisado (4G-A50), aclimatada em meio contendo 75% de hidrolisado (4G-A75) e aclimatada em hidrolisado (4G-A100) 97 A Figura 37 mostra as concentrações de compostos inibidores como 5- hidroximetilfurfural (5-HMF), furfural, ácido acético e glicerol durante a fermentação em hidrolisado ácido de farelo de girassol com a levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G. A linhagem foi capaz de converter totalmente o furfural e o 5-hidroximetilfurfural em compostos de menor toxicidade. A levedura ainda foi capaz de biotransformar o ácido acético, consumindo uma porcentagem pequena de todo ácido presente. Também houve a produção de glicerol durante a fermentação com todas as células, mostrando a utilização desse composto como osmorregulador para manter o equilíbrio intracelular. Os resultados referentes à produção de etanol e parâmetros fermentativos estão apresentados na Tabela 17. O rendimento de etanol (YP/S) e eficiência fermentativa (Ef) foram calculados após 16 h de fermentação. A taxa de consumo de glicose (-rglicose) e de xilose (-rxilose) foram calculadas com 8 h de fermentação, visto que as primeiras horas de fermentação foram essenciais para identificar diferenças entre as fermentações e após esse tempo já não havia glicose presente no meio. Ademais, a produtividade volumétrica (Qp) também foi calculada com 8 h de fermentação, pois se faz necessário que o cálculo considere o consumo de glicose, que afeta diretamente a produtividade. A produção total de etanol (ΔP) e o consumo total de substrato (ΔS) foram calculados com 28 h de fermentação. Tabela 17. Parâmetros do processo fermentativo conduzido com as linhagens aclimatadas e não aclimatadas da levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G, em hidrolisado ácido de farelo de semente de girassol Candida orthopsilosis UFVJM-4G Linhagens 4G-A0 4G-A25 4G-A50 4G-A75 4G-A100 YP/S (gp gs-1) 0,34±0,03b 0,42±0,04ab 0,50±0,02a 0,35±0,01b 0,32±0,05b Ef (%) 66,84±0,06b 82,40±0,07ab 98,57±0,03a 68,17±0,02b 62,17±0,09b QP (g L-1 h-1) 0,32±0,04b 0,34±0,01b 0,42±0,01a 0,47±0,02a 0,47±0,01a ΔS (gaçúcar L-1) 14,10±0,93b 13,58±1,02b 13,46±0,50b 16,56±0,53a 17,47±0,57a ΔP (getanol L-1) 4,45±0,17b 4,52±0,38ab 4,67±0,30ab 5,17±0,09ab 5,26±0,15a -rglicose (h-1) 0,45±0,03a 0,49±0,02a 0,52±0,02a 0,62±0,02b 0,64±0,02b -rxilose (h-1) 0,24±0,01b 0,09±0,05c 0,12±0,02c 0,41±0,02a 0,47±0,03a Letras idênticas na mesma linha indicam que não há diferença estatística ao nível de 95% de significância. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA, 2022 Observando os resultados do rendimento de etanol (YP/S) e rendimento fermentativo (Ef) pode-se perceber que a levedura aclimatada em 50% de hidrolisado (4G-A50) obteve 98 valores mais altos, alcançando 98,57% do rendimento teórico. Quanto à produtividade volumétrica (Qp) os maiores valores alcançados foram durante as fermentações com as células aclimatadas em 100%, 75% e 50% de hidrolisado (4G-A50, 4G-A75 e 4G-A100). Pode-se observar que as taxas de consumo de glicose e xilose foram maiores e mais rápidas para células 4G-A75 e 4G-A100, fato confirmado também por meio do valor de consumo total de açúcares (ΔS) que foi maior durante a fermentação com as células aclimatadas 4G-A75 e 4G-A100. A produção de etanol total foi maior quando utilizada como agente fermentativo as células 4G-A100. Ademais, como mostrado anteriormente, os parâmetros de crescimento pesquisados, tais como velocidade de crescimento e tempo de geração, foram melhores quando utilizada as células 4G-A75, como demonstrado na Tabela 15. Aparentemente, a levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G foi mais susceptível ao melhoramento promovido pelo processo de adaptação celular. Uma busca na literatura foi realizada e foi descrito na Tabela 18 um apanhado de informações sobre os parâmetros fermentativos em processos conduzidos em hidrolisados com agentes leveduriformes. A comparação com o presente estudo foi realizada por meio dos valores obtidos pelas leveduras aclimatadas em 100% de hidrolisado (A100). A análise dos resultados comparativos indica que os valores dos parâmetros fermentativos obtidos no presente trabalho são superiores, com exceção da Kluyveromyces marxianus, que obteve um rendimento de 0,46 getanol gsubstrato-1 e foi capaz de assimilar também a arabinose presente no hidrolisado de palha de trigo (DU et al., 2022). Essas cepas de leveduras, C. akabanensis e C. orthopsilosis, possuem um potencial grande para aplicação em processos fermentativos industriais. Todavia, muitas informações sobre as espécies aqui avaliadas ainda são desconhecidas, visto que são escassos os estudos sobre essas leveduras. Há uma necessidade de pesquisar e investigar ainda mais essas linhagens, bem como definir as melhores condições para o processo fermentativo. 99 Tabela 18. Comparação do desempenho da fermentação de diferentes leveduras utilizando hidrolisado Agente fermentativo Meio de cultivo µm (h-1) YP/S (getanol gsubstrato-1) Qp (g L-1 h-1) Ef (%) Referência Candida akabanensis (R131-A100) Hidrolisado de torta de girassol 0,21±0,01 0,43±0,10 0,35±0,01 86,42±0,19 Presente estudo Candida orthopsilosis (4G- A50) Hidrolisado de torta de girassol 0,28±0,03 0,50±0,02 0,42±0,01 98,57±0,03 Presente estudo Candida akabanensis Hidrolisado de torta de girassol sem suplementação - 0,27±0,02 0,21±0,01 52,19±4,83 Matos et al. (2018) Scheffersomyces stipitis Hidrolisado de casca de arroz enriquecido com xilose 0.08 0,33 0,06 65 Bader, et al. (2022) Scheffersomyces stipitis Hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz desacetilado - 0,37 0,30 - Castro et al. (2017) Kluyveromyces marxianus adaptada Hidrolisado de palha de milho - 0,46 - 90,02 Du et al. (2022) Spathaspora passalidarum adaptada Hidrolisado de Eucalyptus globulus 0,36 0,55 70,45 Morales et al. (2017) Saccharomyces cerevisiae Hidrolisado ácido de bagaço de cana- de-açúcar 0,0024 0,08 0,011 2,15 Codato, et al. (2021) Saccharomyces cerevisiae modificada Hidrolisado ácido de macroalga verde Ulva prolifera - 0,242 ± 0,002 - 47,36 Dave et al. (2021) 100 101 6 CONCLUSÃO A realização do presente estudo permitiu observar que: • A biomassa de farelo de semente de girassol possui frações de hemicelulose, celulose e amido que juntas representam quase 50% da biomassa seca, o que a torna uma biomassa potencial para produção de etanol. • O hidrolisado ácido da torta de girassol apresentou a presença 5- hidroximetilfurfural, furfural e ácido acético, reconhecidos como inibidores fermentativos. Além disso, observou-se alta concentração de pentoses e menores concentração de glicose, sugerindo que a condição de hidrólise foi seletiva para hemicelulose. • As linhagens conservadas em 10% v/v de glicerol por mais de um ano foram reativadas e as colônias apresentaram rápido crescimento. A partir dos ensaios morfológicos foi possível autenticar as leveduras através de suas características macro e microscópicas e constatar culturas puras e sem contaminação. • O processo de adaptação celular foi eficiente para a levedura Candida orthopsilosis UFVJM-4G, que obteve resultados melhores de crescimento, rendimento de etanol e produtividade volumétrica. A levedura Candida akabanensis UFVJM-R131 não se favoreceu do processo de adaptação, mas mostrou-se tão resiliente e eficiente quanto a levedura C. orthopsilosis adaptada. • As leveduras fermentadoras de pentose não convencionais aqui avaliadas mostraram-se eficientes para produção de etanol 2G alcançando resultados satisfatórios em comparação com a literatura atual. 102 103 7 PERSPECTIVAS FUTURAS A realização do trabalho abre um leque de possibilidades para a investigação dos micro-organismos estudados, por exemplo, o perfil fermentativo das leveduras aclimatas frente à outros hidrolisados lignocelulósicos. Outro questionamento seria a influência dos inibidores fermentativos para as células das leveduras aclimatadas, definindo qual a concentração máxima que a levedura consegue suportar no meio fermentativo. Além disso, efeitos do pH, temperatura, agitação e oxigenação poderiam ser explorados à procura de uma otimização do processo. 104 105 8 REFERÊNCIAS ABUD, A. K. S; SILVA, C. E. F. Bioethanol in Brazil: Status, Challenges and Perspectives to Improve the Production. Bioethanol Production From Food Crops, p. 417-443, 2019. ACHINAS, S.; EUVERINK, G. J. W. Consolidated briefing of biochemical ethanol production from lignocellulosic biomass. Electronic Journal of Biotechnology, v. 23, p. 44– 53, 2016. ALEXANDRIDIS, P. et al. Solvent processing of cellulose for effective bioresource utilization. Current Opinion in Green and Sustainable Chemistry, v. 14, p. 40–52, 2018. ALMEIDA, S. C.; NASCIMENTO, D. D. DO R. Revisão: leveduras utilizadas na produção de etanol de segunda geração. 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